Идентификация нового сайта метилирования в промоторном районе гена Sept9 для диагностики гепатоцеллюлярной карциномы

Введение. Ежегодно во всем мире от гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) умирают более 600 тыс. человек. Заболевание часто выявляется на поздних стадиях и во многих случаях является некурабельным. Ранняя диагностика и мониторинг развития рецидивов ГЦК продолжают оставаться существенной проблемой клинической онкологии. Это определяет актуальность поиска высокочувствительных и специфичных биомаркеров для неинвазивной диагностики ГЦК.

Цель исследования – идентификация гиперметилированного при ГЦК локуса в промоторном районе гена септин 9 (Sept9) на основании анализа общедоступных данных метиломных исследований; экспериментальная валидация метилирования на пилотной панели парных клинических образцов пациентов с ГЦК, а также образцов ткани пациентов с доброкачественными опухолями печени и лимфоцитов здоровых доноров.

Материалы и методы. Для анализа метиломных данных были использованы выборки ГЦК TCGA, гепатоцеллюлярной аденомы из депозитария GEO (Gene Expression Omnibus), а также клеток периферической крови и тканей здоровых доноров Methbank. Экспериментальную валидацию уровней метилирования идентифицированного сайта проводили на пилотной выборке клинических образцов с использованием метода бисульфитного пиросеквенирования на приборе PyroMark Q24.

Результаты. На основании анализа метиломных данных нами был выбран сайт cg20275528, который характеризуется высоким уровнем метилирования в тканях ГЦК и минимальными уровнями метилирования в клетках неопухолевой ткани печени, гепатоцеллюлярной аденомы и периферической крови здоровых доноров. Экспериментальная проверка на пилотной выборке клинических образцов показала, что уровень метилирования маркерного сайта в ГЦК (медиана 42 %) значительно выше, чем в неопухолевых тканях печени (медиана 3 %) и доброкачественных новообразованиях (медиана 1,5 %) и превышает пороговое значение в ГЦК по сравнению с парными образцами прилежащей неопухолевой ткани печени в 20 (66,6 %) из 30 исследованных случаев. Показана принципиальная возможность детекции метилирования cg20275528 в циркулирующей ДНК плазмы больных ГЦК.

Заключение. Полученные результаты позволяют предположить, что разработанный и апробированный в этой работе подход к поиску и экспериментальной верификации диагностически значимых маркеров может быть использован для выявления новых дифференциально метилированных сайтов и разработки новых подходов к неинвазивной диагностике ГЦК.

1. Bray F., Ferlay J., Soerjomataram I. et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortal ity worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin 2018. DOI: 10.3322/caac.21492.

2. Llovet J.M., Zucman-Rossi J., Pikarsky E. et al. Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primers 2016;2:16018. DOI: 10.1038/nrdp.2016.18.

3. Kulik L., El-Serag H.B. Epidemiology and management of hepatocellular carcinoma. Gastroenterology 2019;156(2):477–91.e1. DOI: 10.1053/j.gastro.2018.08.065.

4. Abelev G.I., Eraiser T.L. Cellular aspects of alpha-fetoprotein reexpression in tumors. Semin Cancer Biol 1999;9(2):95–107.

5. Rich N., Singal A.G. Hepatocellular carcinoma tumour markers: current role and expectations. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2014;28(5):843–53. DOI: 10.1016/j.bpg.2014.07.018.

6. Gai W., Sun K. Epigenetic Biomarkers in Cell-Free DNA and Applications in Liq uid Biopsy. Genes (Basel) 2019;10(1). DOI: 10.3390/genes10010032.

7. Кустова И.Ф., Макарова А.С., Лазаревич Н.Л. Потенциал использования биомаркеров метилирования для диагностики и прогноза гепатоцеллюлярной карциномы методом жидкостной биопсии. Успехи молекулярной онкологии 2018;5(4):8–19. DOI: 10.17650/2313-805X-2018.

8. De Vos T., Tetzner R., Model F. et al. Circulating methylated SEPT9 DNA in plasma is a biomarker for colorectal cancer. Clin Chem 2009;55(7):1337–46. DOI: 10.1373/clinchem.2008.115808.

9. Wasserkort R., Kalmar A., Valcz G. et al. Aberrant septin 9 DNA methylation in colorectal cancer is restricted to a single CpG island. BMC Cancer 2013;13:398. DOI: 10.1186/1471-2407-13-398.

10. Epigenomics, 2016. Epi proColon®. Available at: https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf13/P130001C.pdf. Accessed date: 1 October 2019.

11. Shen N., Wang T., Li D. et al. Hyper methylation of the Sept9 gene suggests significantly poor prognosis in cancer patients: a systematic review and metaanalysis. Front Genet 2019;10:887. DOI: 10.3389/fgene.2019.00887.

12. Villanueva A., Portela A., Sayols S. et al. DNA methylation-based prognosis and epidrivers in hepatocellular carcinoma. Hepatology 2015;61(6):1945–56. DOI: 10.1002/hep.27732.

13. Oussalah A., Rischer S., Bensenane M. et al. Plasma mSEPT9: a novel circulating cell-free DNA-based epigenetic biomarker to diagnose hepatocellular carcinoma. EBioMedicine 2018;30:138–47. DOI: 10.1016/j.ebiom.2018.03.029.

14. Li J., Zhou X., Liu X. Detection of colorectal cancer in circulating cell-free DNA by methylated CpG tandem amplification and sequencing. Clin Chem 2019;65(7):916–26. DOI: 10.1373/clinchem.2019.301804.

15. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma. Cell 2017;169(7):1327–41.e23. DOI: 10.1016/j.cell.2017.05.046.

16. Li L.C., Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bio informatics 2002;18(11):1427–31. DOI: 10.1093/bioinformatics/18.11.1427.

17. Illumina, 2011. Available at: https://support.illumina.com/array/array_kits/infinium_humanmethylation450_beadchip_kit/downloads.html. Accessed date: 1 October 2019.

18. Xiong Y., Wei Y., Gu Y. et al. DiseaseMeth version 2.0: a major expansion and update of the human disease methylation database. Nucleic Acids Res 2017;45(D1):D888–95. DOI: 10.1093/nar/gkw1123.

19. Li R., Liang F., Li M. et al. MethBank 3.0: a database of DNA methylomes across a variety of species. Nucleic Acids Res 2018;46(D1):D288–95. DOI: 10.1093/nar/gkx1139.

20. Состояние онкологической помощи населению России в 2017 году. Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2018. 236 с.

21. Wittwer C.T., Herrmann M.G., Moss A.A., Rasmussen R.P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques 1997;22(1):130–1. DOI: 10.2144/97221bi01.

22. Malentacchi F., Forni G., Vinci S., Orlando C. Quantitative evaluation of DNA methylation by optimization of a differentialhigh resolution melt analysis protocol. Nucleic Acids Res 2009;37(12):e86. DOI: 10.1093/nar/gkp383.

23. Bergheim J., Semaan A., Gevensleben H. et al. Potential of quantitative SEPT9 and SHOX2 methylation in plasmatic circulating cell-free DNA as auxiliary staging parameter in colorectal cancer: a prospective observational cohort study. Br J Cancer 2018;118(9):1217–28. DOI: 10.1038/s41416-018-0035-8.

24. Song L., Yu H., Jia J., Li Y. A systematic review of the performance of the SEPT9 gene methylation assay in colorectal cancer screening, monitoring, diagnosis and prognosis. Cancer Biomark 2017;18(4):425–32. DOI: 10.3233/CBM-160321.