Новые подходы в 3D-моделировании роста in vitro первичных культур злокачественных глиом

Введение. Заболеваемость глиомами головного мозга прочно занимает лидирующую позицию среди всех опухолей центральной нервной системы – 40–50 % выявленных случаев, более половины из них представлены глиобластомой. Существующие клеточные линии и методы культивирования не отражают всех особенностей трехмерной (3D) организации нативной глиобластомы. Применение темозоломида приводит к развитию лекарственной устойчивости и острого рецидива с последующим плохим клиническим исходом. Развитие резистентности в значительной степени связано с наличием в популяции опухолевых стволовых клеток и внутриопухолевой гетерогенностью. Получение 3D-культур из первичного материала позволит сохранить пул стволовых клеток и специфические для конкретной опухоли особенности.

Цель исследования – получить 3D-модель на основе первичных клеточных культур, позволяющую сохранить гетерогенную популяцию и исходный фенотип опухолевых клеток.

Материалы и методы. Использованы клетки линии человеческой глиомы U-87MG и первичная клеточная культура GBM002, полученная из операционного материала, с подтвержденным диагнозом глиобластомы. Из клеточных линий были получены нейросферы, рост которых контролировали с помощью автоматической системы для клеточного анализа InCell Analyzer 6000. Для определения содержания клеток CD133+ использовали метод проточной цитометрии. Оценку экспрессии в нейросферах рецепторных тирозинкиназ VEGFR1, VEGFR2 (рецепторы эндотелиального фактора роста 1‑го и 2‑го типов), FGFR2 (рецептор фактора роста фибробластов 2‑го типа) и маркера гипоксии HIF-1α (фактор, индуцируемый гипоксией, 1α) проводили с помощью конфокальной микроскопии.

Результаты. Клетки глиобластомы GBM002, выделенные из операционного материала, образовывали нейросферы, при этом повышалось количество клеток CD133+ с 1–2 до 16–19 % по сравнению с двухмерными культурами. При длительном культивировании клеток с нецитотоксическими дозами темозоломида установлено, что такие клетки образуют нейросферы меньшего размера по сравнению с контрольными клетками. Показано, что экспрессия рецепторных тирозинкиназ при культивировании клеток глиобластомы GBM002 в нейросферах отличается от таковой в двухмерных культурах. Установлено, что в нейросферах в значительной степени увеличивается экспрессия FGFR2 и VEGFR1.

Заключение. 3D-культивирование первичных культур позволяет получать более гетерогенную популяцию опухолевых клеток, отражающую пространственную неоднородность клеток, повышать пул стволовых клеток и воссоздавать условия гипоксии внутри микроопухолей головного мозга.

1. Zong H., Verhaak R.G.W., Canoll P. The cellular origin for malignant glioma and prospects for clinical advancements. Expert Rev Mol Diagn 2012;4(12):383–94. DOI: 10.1586/erm.12.30.

2. Venur V.A., Peereboom D.M., Ahluwalia M.S. Current medical treatment of glioblastoma. Cancer Treat Res 2015;(163):103–15. DOI: 10.1007/978-3319-12048-5_7.

3. Morokoff A., Ng W., Gogos A., Kaye A.H. Molecular subtypes, stem cells and heterogeneity: Implications for personalised therapy in glioma. J Clin Neuroscie 2015;8(22):1219– 26. DOI: 10.1016/j.jocn.2015.02.008.

4. Bez A., Corsini E., Curti D. et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res 2003;1–2(993):18–29. DOI: 10.1016/j.brainres.2003.08.061.

5. Kahlert U.D., Koch K., Suwala A.K. et al. The effect of neurosphere culture conditions on the cellular metabolism of glioma cells. Folia Neuropathol 2015;3(53):219– 25. DOI: 10.5114/fn.2015.54422.

6. Platet N., Liu S.Y., Atifi M.E. et al. Influence of oxygen tension on CD133 phenotype in human glioma cell cultures. Cancer Lett 2007;258(2):286–90. DOI: 10.1016/j.canlet.2007.09.012.