Preview

Успехи молекулярной онкологии

Расширенный поиск

Жидкостная биопсия колоректального рака: новый подход к оценке аберрантного метилирования гена SEPT9

https://doi.org/10.17650/2313-805X-2021-8-4-53-60

Полный текст:

Аннотация

Введение. Гиперметилированные CpG-островки в промоторах генов-супрессоров (в частности, SEPT9) – клинически значимые опухолевые маркеры, широко используемые в жидкостной биопсии. Для количественной оценки гиперметилированных ДНК обычно используют полимеразную цепную реакцию в реальном времени с метилспецифическими праймерами. Этот метод требует нормализации данных, зависит от степени вариабельности числа копий генов-калибраторов и весьма трудоемок.

Цель исследования – разработка альтернативного метода оценки аберрантного метилирования посредством количественного анализа плавления ДНК (qDMA, quantitative DNA melting analysis).

Материалы и методы. Образцы ДНК, выделенные из плазмы крови здоровых доноров и больных колоректальным раком, анализировали методом qDMA, включающим: 1) асимметричную полимеразную цепную реакцию с метилнезависимыми индивидуально подобранными праймерами к гену SEPT9; 2) использование зонда TaqMan, гибридизующегося с 2 CpG-динуклеотидами ампликона; 3) постамплификационное плавление гибридов зонд/ампликон; 4) количественный анализ плавления ДНК.

Результаты. Метод испытан на гене SEPT9 (применялся в жидкостной биопсии колоректального рака). Различия в степени метилирования SEPT9 между группами здоровых (n = 41) и больных (n = 39) людей статистически значимы (p <0,0001). Определена диагностическая эффективность qDMA: AUC ROC (area under curve – площадь под ROC-кривой) – 0,812 (после перекрестной валидизации – 0,801), чувствительность – 90 %, специфичность – 66 %.

Заключение. Предлагаемый метод количественной оценки аберрантно метилированных ДНК прост, реализуется в закрытом формате, не требует нормализации и построения стандартных кривых. Предполагается возможность его оптимизации посредством применения мультиплексного варианта с одновременным анализом нескольких маркеров.

Об авторах

И. В. Ботезату
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Россия

115478 Москва, Каширское шоссе, 24



В. Н. Кондратова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Россия

115478 Москва, Каширское шоссе, 24



А. М. Строганова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Россия

115478 Москва, Каширское шоссе, 24



С. Л. Дранко
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Россия

115478 Москва, Каширское шоссе, 24



А. В. Лихтенштейн
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Россия

Анатолий Владимирович Лихтенштейн

115478 Москва, Каширское шоссе, 24



Список литературы

1. Serrano M.J., Garrido-Navas M.C., Diaz Mochon J.J. et al. Precision prevention and cancer interception: the new challenges of liquid biopsy. Cancer Discovery 2020;10(11):1635–44. DOI: 10.1158/2159-8290.CD-20-0466.

2. Cescon D.W., Bratman S.V., Chan S.M. et al. Circulating tumor DNA and liquid biopsy in oncology. Nature Cancer 2020;1:276–90. DOI: 10.1038/s43018-020-0043-5.

3. Xiong Z., Laird P.W. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res 1997;25(12):2532–4. DOI: 10.1093/nar/25.12.2532.

4. Worm J., Aggerholm A., Guldberg P. In-tube DNA methylation profiling by fluorescence melting curve analysis. Clinical Chemistry 2001;47(7):1183–9.

5. Tse M.Y., Ashbury J.E., Zwingerman N. et al. A refined, rapid and reproducible high resolution melt (HRM)-based method suitable for quantification of global LINE-1 repetitive element methylation. BMC Research Notes 2011;4:565. DOI: 10.1186/1756-0500-4-565.

6. Quillien V., Lavenu A., Karayan-Tapon L. et al. Comparative assessment of 5 methods (methylation-specific polymerase chain reaction, MethyLight, pyrosequencing, methylation-sensitive high-resolution melting, and immunohistochemistry) to analyze O6-methylguanine-DNA-methyltranferase in a series of 100 glioblastoma patients. Cancer 2012;118(17):4201–11. DOI: 10.1002/cncr.27392.

7. Korshunova Y., Maloney R.K., Lakey N. et al. Massively parallel bisulphite pyrosequencing reveals the molecular complexity of breast cancer-associated cytosine-methylation patterns obtained from tissue and serum DNA. Genome Res 2008;18(1):19–29. DOI: 10.1101/gr.6883307.

8. Sepulveda A.R., Jones D., Ogino S. et al. CpG methylation analysis-current status of clinical assays and potential applications in molecular diagnostics: a report of the Association for Molecular Pathology. J Mol Diagn 2009;11(4):266–78. DOI: 10.2353/jmoldx.2009.080125.

9. Egger G., Wielscher M., Pulverer W. et al. DNA methylation testing and marker validation using PCR: diagnostic applications. Expert Rev Mol Diagn 2012;12(1):75–92. DOI: 10.1586/erm.11.90.

10. Dietrich D., Jung M., Puetzer S. et al. Diagnostic and prognostic value of SHOX2 and SEPT9 DNA methylation and cytology in benign, paramalignant and malignant pleural effusions. PLoS ONE 2013;8(12):e84225. DOI: 10.1371/journal.pone.0084225.

11. De Vos L., Gevensleben H., Schrock A. et al. Comparison of quantification algorithms for circulating cell-free DNA methylation biomarkers in blood plasma from cancer patients. Clin Epigenetics 2017;9(1):125. DOI: 10.1186/s13148-017-0425-4.

12. Pharo H.D., Honne H., Vedeld H.M. et al. Experimental factors affecting the robustness of DNA methylation analysis. Sci Rep 2016;6:33936. DOI: 10.1038/srep33936.

13. Pharo H.D., Andresen K., Berg K.C.G. et al. A robust internal control for high-precision DNA methylation analyses by droplet digital PCR. Clin Epigenetics 2018;10:24. DOI: 10.1186/s13148-018-0456-5.

14. Warnecke P.M., Stirzaker C., Melki J.R. et al. Detection and measurement of PCR bias in quantitative methylation analysis of bisulphite-treated DNA. Nucleic Acids Res 1997;25(21):4422–6. DOI: 10.1093/nar/25.21.4422.

15. Wojdacz T.K., Hansen L.L., Dobrovic A. A new approach to primer design for the control of PCR bias in methylation studies. BMC Res Notes 2008;1:54. DOI: 10.1186/1756-0500-1-54.

16. Wojdacz T.K., Borgbo T., Hansen L.L. Primer design versus PCR bias in methylation independent PCR amplifications. Epigenetics 2009;4(4):231–4. DOI: 10.4161/epi.9020.

17. Botezatu I.V., Kondratova V.N., Shelepov V.P. et al. Asymmetric mutantenriched polymerase chain reaction and quantitative DNA melting analysis of KRAS mutation in colorectal cancer. Anal Biochem 2020;590:1–9. DOI: 10.1016/j.ab.2019.113517.

18. Kondratova V.N., Botezatu I.V., Shelepov V.P. et al. SLAM-MS: mutation scanning of stem-loop amplicons with TaqMan probes by quantitative DNA melting analysis. Sci Rep 2020;10:5476. DOI: 10.1038/s41598-020-62173-x.

19. Лазаревич Н.Л., Абрамов П.М., Федорова М.Д. и др. Идентификация нового сайта метилирования в промоторном районе гена Sept9 для диагностики гепатоцеллюлярной карциномы. Успехи молекулярной онкологии 2019;6(4):26–37. DOI: 10.17650/2313-805X-2019-6-4-26-37.

20. Sui J., Wu X., Wang C. et al. Discovery and validation of methylation signatures in blood-based circulating tumor cell-free DNA in early detection of colorectal carcinoma: a case-control study. Clin Epigenetics 2021;13:26. DOI: 10.1186/s13148-020-00985-4.

21. Wasserkort R., Kalmar A., Valcz G. et al. Aberrant septin 9 DNA methylation in colorectal cancer is restricted to a single CpG island. BMC Cancer 2013;13:398. DOI: 10.1186/1471-2407-13-398.

22. Schutz E., von Ahsen N. Spreadsheet software for thermodynamic melting point prediction of oligonucleotide hybridization with and without mismatches. Biotechniques 1999;27(6):1218–22, 1224. DOI: 10.2144/99276bc04.

23. Mazzara S., Rossi R.L., Grifantini R. et al. CombiROC: an interactive web tool for selecting accurate marker combinations of omics data. Sci Rep 2017;7:45477. DOI: 10.1038/srep45477.

24. Botezatu I.V., Panchuk I.O., Stroganova A.M. et al. TaqMan probes as blocking agents for enriched PCR amplification and DNA melting analysis of mutant genes. Biotechniques 2017;62(2):62–8. DOI: 10.2144/000114515.

25. Montgomery J.L., Rejali N., Wittwer C.T. The influence of nucleotide sequence and temperature on the activity of thermostable DNA polymerases. J MolDiagn 2014;16(3):305–13. DOI: 10.1016/j.jmoldx.2014.01.006.

26. Livak K.J., Flood S.J., Marmaro J. et al. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl 1995;4(6):357–62. DOI: 10.1101/gr.4.6.357.

27. Huang Q., Liu Z., Liao Y. et al. Multiplex fluorescence melting curve analysis for mutation detection with dual-labeled, self-quenched probes. PLoS ONE 2011;6(4):e19206. DOI: 10.1371/journal.pone.0019206.

28. Botezatu I.V., Nechaeva I.O., Stroganova C.A. et al. Optimization of melting analysis with Taqman probes for detection of KRAS, NRAS and BRAF mutations. Anal Biochem 2015;491:75–83. DOI: 10.1016/j.ab.2015.09.005.

29. Armbruster D.A., Pry T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin Biochem Rev 2008;29(Suppl 1):S49–52.

30. Wojdacz T.K., Dobrovic A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS- HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res 2007;35(6):e41. DOI: 10.1093/nar/gkm013.

31. Malentacchi F., Forni G., Vinci S. et al. Quantitative evaluation of DNA methylation by optimization of a differential-high resolution melt analysis protocol. Nucleic Acids Res 2009;37(12):e86. DOI: 10.1093/nar/gkp383.

32. Spitzwieser M., Entfellner E., Werner B. et al. Hypermethylation of CDKN2A exon 2 in tumor, tumor-adjacent and tumor-distant tissues from breast cancer patients. BMC Cancer 2017;17:260. DOI: 10.1186/s12885-017-3244-2.


Для цитирования:


Ботезату И.В., Кондратова В.Н., Строганова А.М., Дранко С.Л., Лихтенштейн А.В. Жидкостная биопсия колоректального рака: новый подход к оценке аберрантного метилирования гена SEPT9. Успехи молекулярной онкологии. 2021;8(4):53-60. https://doi.org/10.17650/2313-805X-2021-8-4-53-60

For citation:


Botezatu I.V., Kondratova V.N., Stroganova A.M., Dranko S.L., Lichtenstein A.V. Liquid biopsy of colorectal cancer: a new approach to evaluation of aberrant methylation of the SEPT9 gene. Advances in Molecular Oncology. 2021;8(4):53-60. (In Russ.) https://doi.org/10.17650/2313-805X-2021-8-4-53-60

Просмотров: 37


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2313-805X (Print)
ISSN 2413-3787 (Online)
X