Методы детекции специфических для опухолевой ткани однонуклеотидных соматических мутаций в препаратах цДНК из плазмы крови

Введение. Жидкостная биопсия рассматривается как малоинвазивный способ проведения молекулярно-генетического анализа, который может быть использован для ранней диагностики, прогноза течения заболевания, мониторинга остаточной болезни или результатов лечения, а также выбора оптимальных для пациента схем лекарственной терапии. Наряду с разработкой тестов, основанных на исследовании панелей онкологически значимых генов или их участков, для различных форм генетически гетерогенных опухолей перспективным подходом может стать использование в качестве объекта жидкостной биопсии индивидуального спектра соматических мутаций конкретного больного, которые могут быть выявлены с помощью высокопроизводительного секвенирования опухолевой ткани.

Цель исследования - определить возможность использования различных методов детекции однонуклеотидных соматических мутаций, выявленных в опухолевой ткани конкретного пациента, в препаратах циркулирующей ДНК (цДНК) из плазмы крови, полученных до хирургического удаления опухоли, и выявить возможность количественной оценки доли альтернативного варианта в общем пуле цДНК.

Материалы и методы. В работе использованы препараты нормальной и опухолевой тканей, плазмы крови пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой, а также различные методы детекции однонуклеотидных соматических мутаций: полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени с интеркалирующим красителем или с зондами TaqMan, капельная цифровая ПЦР и высокопроизводительное секвенирование таргетных ампликонов.

Результаты. На примере соматической мутации в гене TLN1, выявленной в опухолевой ткани пациента с гепатоцеллюлярной карциномой, разработаны и апробированы методы, каждый из которых позволяет специфично детектировать мутантный вариант в малых количествах (2 нг) цДНК из плазмы крови того же пациента. использование капельной ПЦР и секвенирования таргетных ампликонов позволило провести количественную оценку долей мутантного варианта в общем пуле цДНК, которые составили 19,7 и 23,5 % соответственно.

Заключение. Капельная цифровая ПЦР и таргетное секвенирование ампликонов позволяют не только надежно детектировать мутантные варианты в малых количествах цДНК, но и адекватно проводить их количественную оценку, что особенно важно для разработки способов мониторинга опухолевого роста в процессе лечения. Близкие значения доли мутантного варианта в цДНК, детектированной этими методами, свидетельствуют о точности количественного анализа и возможности их использования для кросс-валидации получаемых результатов.