Методы детекции специфических для опухолевой ткани однонуклеотидных соматических мутаций в препаратах цДНК из плазмы крови

Введение. Жидкостная биопсия рассматривается как малоинвазивный способ проведения молекулярно-генетического анализа, который может быть использован для ранней диагностики, прогноза течения заболевания, мониторинга остаточной болезни или результатов лечения, а также выбора оптимальных для пациента схем лекарственной терапии. Наряду с разработкой тестов, основанных на исследовании панелей онкологически значимых генов или их участков, для различных форм генетически гетерогенных опухолей перспективным подходом может стать использование в качестве объекта жидкостной биопсии индивидуального спектра соматических мутаций конкретного больного, которые могут быть выявлены с помощью высокопроизводительного секвенирования опухолевой ткани.

Цель исследования - определить возможность использования различных методов детекции однонуклеотидных соматических мутаций, выявленных в опухолевой ткани конкретного пациента, в препаратах циркулирующей ДНК (цДНК) из плазмы крови, полученных до хирургического удаления опухоли, и выявить возможность количественной оценки доли альтернативного варианта в общем пуле цДНК.

Материалы и методы. В работе использованы препараты нормальной и опухолевой тканей, плазмы крови пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой, а также различные методы детекции однонуклеотидных соматических мутаций: полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени с интеркалирующим красителем или с зондами TaqMan, капельная цифровая ПЦР и высокопроизводительное секвенирование таргетных ампликонов.

Результаты. На примере соматической мутации в гене TLN1, выявленной в опухолевой ткани пациента с гепатоцеллюлярной карциномой, разработаны и апробированы методы, каждый из которых позволяет специфично детектировать мутантный вариант в малых количествах (2 нг) цДНК из плазмы крови того же пациента. использование капельной ПЦР и секвенирования таргетных ампликонов позволило провести количественную оценку долей мутантного варианта в общем пуле цДНК, которые составили 19,7 и 23,5 % соответственно.

Заключение. Капельная цифровая ПЦР и таргетное секвенирование ампликонов позволяют не только надежно детектировать мутантные варианты в малых количествах цДНК, но и адекватно проводить их количественную оценку, что особенно важно для разработки способов мониторинга опухолевого роста в процессе лечения. Близкие значения доли мутантного варианта в цДНК, детектированной этими методами, свидетельствуют о точности количественного анализа и возможности их использования для кросс-валидации получаемых результатов.

1. Siravegna G., Marsoni S., Siena S., Bardelli A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nat Rev Clin Oncol 2017;14(9):531-48. DOI: 10.1038/nrclinonc.2017.14

2. Wan J.C.M., Massie C., Garcia-Corbacho J. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA. Nat Rev Cancer 2017;17(4):223-38. DOI: 10.1038/nrc.2017.7

3. Cescon D.W., Bratman S.V., Chan S.M., Siu L.L. Circulating tumor DNA and liquid biopsy in oncology. Nat Cancer 2020;1(3):276-90. DOI: 10.1038/s43018-020-0043-5

4. Kilgour E., Rothwell D.G., Brady G., Dive C. Liquid biopsy-based biomarkers of treatment response and resistance. Cancer Cell 2020;37(4):485-95. DOI: 10.1016/j.ccell.2020.03.012

5. Cisneros-Villanueva M., Hidalgo-Perez L., Rios-Romero M. et al. Cell-free DNA analysis in current cancer clinical trials: a review. Br J Cancer 2022;126(3):391-400. DOI: 10.1038/s41416-021-01696-0

6. Keppens C., Palma J.F., Das P.M. Detection of EGFR variants in plasma: a multilaboratory comparison of a Real-Time PCR EGFR Mutation test in Europe. J Mol Diagn 2018;20(4):483-94. DOI: 10.1016/j.jmoldx.2018.03.006

7. Sung H., Ferlay J., Siegel R.L. et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin 2021;71(3): 209-49. DOI: 10.3322/caac.21660

8. Llovet J.M., Zucman-Rossi J., Pikarsky E. Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primers 2016;2:16018. DOI: 10.1038/nrdp.2016.18

9. Zucman-Rossi J., Villanueva A., Nault J.C. et al. Genetic landscape and biomarkers of hepatocellular carcinoma. Gastroenterology 2015;149(5):1226-39. PMID: 26099527. DOI: 10.1053/j.gastro.2015.05.061.

10. Comprehensive and integrative genomic characterization of hepatocellular carcinoma. Cell 2017;169(7):1327-41. DOI: 10.1016/j.cell.2017.05.046

11. Кустова И.Ф., Макарова А.С., Лазаревич Н.Л. Потенциал использования биомаркеров метилирования для диагностики и прогноза гепатоцеллюлярной карциномы методом жидкостной биопсии. Успехи молекулярной онкологии 2018;5(4):8-19. DOI: 10.17650/2313-805X-2018

12. Tran N.H., Kisiel J., Roberts L.R. Using cell-free DNA for HCC surveillance and prognosis. JHEP Rep 2021;3(4):100304. DOI: 10.1016/j.jhepr.2021.100304

13. Thorvaldsdottir H., Robinson J.T., Mesirov J.P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Brief Bioinform 2013;14(2):178-92. DOI: 10.1093/bib/bbs017

14. Liu J., Huang Sh., Sun M. et al. An improved allele-specific PCR primer design method for SNP marker analysis and its application. Plant Methods 2012;8(1):34. DOI: 10.1186/17464811-8-34

15. Ng C.K.Y., Di Costanzo G.G., Terracciano L.M., Piscuoglio S. Circulating cell-free DNA in hepatocellular carcinoma: current insights and outlook. Front Med (Lausanne) 2018;5:78. DOI: 10.3389/fmed.2018.00078

16. Labgaa I., Villacorta-Martin C., D'Avola D. et al. A pilot study of ultra-deep targeted sequencing of plasma DNA identifies driver mutations in hepatocellular carcinoma. Oncogene 2018;37:3740-52. DOI: 10.1038/s41388-018-0206-3

17. Bratman S.V., Yang S.Y.C., Iafolla M.A.J. et al. Personalized circulating tumor DNA analysis as a predictive biomarker in solid tumor patients treated with pembro-lizumab. Nat Cancer 2020;1(9):873-81. DOI: 10.1038/s43018-020-0096-5

18. Ikeda S., Tsigelny I., Skjevik A. et al. Next-generation sequencing of circulating tumor DNA reveals frequent alterations in advanced hepatocellular carcinoma. The Oncologist 2018;23(5):586-93. DOI: 10.1634/theoncologist.2017-0479