Высокочувствительное сканирование генных мутаций: зонды TaqMan как блокирующие агенты

Метод плавления ДНК весьма эффективен в клинической генодиагностике, прост в исполнении, производителен, экономичен и, кроме того, реализуется в «закрытом формате», сводящем к минимуму затраты времени, труда и риск перекрестного загрязнения образцов. Данный метод более чувствительный, чем секвенирование по Сэнгеру (предел обнаружения мутантных аллелей ~5 и ~15 % соответственно), однако уступает в этом отношении другим, более трудоемким и дорогим методам (в частности, капельной цифровой полимеразной цепной реакции (digital droplet PCR)). На гене BRAF (как прототипе) мы разработали оригинальный вариант метода плавления ДНК, основанный на способности зондов TaqMan затруднять движение Taq-полимеразы по матрице. Установлено, что эффект блокирования слабее выражен на мутантной матрице из-за присутствия в дуплексе зонд-ДНК неспаренного основания. Предложен протокол полимеразной цепной реакции, дискриминирующий амплификацию мутантных и нормальных аллелей и обеспечивающий существенное (10-кратное и более) повышение чувствительности мутационного сканирования.

1. Vogelstein B., Papadopoulos N., Velculescu V. E. et al. Cancer genome landscapes. Science 2013;339: 1546–58.

2. Alexandrov L. B., Nik-Zainal S., Wedge D. C. et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature 2013;500:415–21.

3. Borras E., Jurado I., Hernan I. et al. Clinical pharmacogenomic testing of KRAS, BRAF and EGFR mutations by high resolution melting analysis and ultra-deep pyrosequencing. BMC Cancer 2011;11:406.

4. Prior I. A., Lewis P. D., Mattos C. A. Comprehensive survey of ras mutations in cancer. Cancer Res 2012;72: 2457–67.

5. Diaz L. A. Jr, Williams R. T., Wu J. et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature 2012;486(7404):537–40.

6. Misale S., Yaeger R., Hobor S. et al. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer. Nature 2012;486:(7404)532–6.

7. Gerlinger M., Rowan A. J., Horswell S. et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med 2012;366(10):883–92.

8. Narayan A., Carriero N. J., Gettinger S. N. et al. Ultrasensitive measurement of hotspot mutations in tumor DNA in blood using error-suppressed multiplexed deep sequencing. Cancer Res 2012;72(14):3492–8.

9. Huang Q., Liu Z., Liao Y. et al. Multiplex fluorescence melting curve analysis for mutation detection with dual-labeled, self-quenched probes. PLoS One 2011;6(4):e19206.

10. Botezatu I. V., Nechaeva I. O., Stroganova A. M. et al. Optimization of melting analysis with Taqman probes for detection of KRAS, NRAS and BRAF mutations. Anal Biochem 2015;491:75–83.

11. Botezatu I. V., Nechaeva I. O., Stroganova A. M. et al. Asymmetric real-time PCR and multiplex melting curve analysis with TaqMan probes for detecting PIK3CA mutations. Data Brief 2015;5:913–7.

12. Livak K. J., Flood S. J., Marmaro J. et al. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl 1995;4:357–62.

13. Schutz E., von Ahsen N. Spreadsheet software for thermodynamic melting point prediction of oligonucleotide hybridization with and without mismatches. Biotechniques 1999;27:1218–24.

14. Montgomery J. L., Rejali N., Wittwer C. T. The influence of nucleotide sequence and temperature on the activity of thermostable DNA polymerases. J Mol Diagn 2014;16(3):305–13.

15. Smith J., Modrich P. Removal of polymerase-produced mutant sequences from PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 1997;94(13):6847–50.

16. McInerney P., Adams P., Hadi M. Z. Error rate comparison during polymerase chain reaction by DNA polymerase. Mol Biol Int 2014;2014:287430.

17. Guha M., Castellanos-Rizaldos E., Makrigiorgos G. M. DISSECT Method using PNA-LNA clamp improves detection of T790m mutation. PLoS One 2013;8(6):e67782.