Молекулярные механизмы действия кураксина CBL0137 на клетки рака молочной железы in vitro

Введение. Рак молочной железы (РМЖ) – злокачественные новообразования с различным молекулярным профилем, для которых характерны аберрации в механизмах эпигенетической регуляции транскрипции. Одним из таких нарушений, ассоциированных с неблагоприятным прогнозом, является гиперэкспрессия белков семейства BET, ответственных за взаимодействие транскрипционных факторов и областей, богатых ацетилированными гистонами. Ранее мы выявили способность мультитаргетного эпигенетически активного агента кураксина CBL0137 (CBL) ингибировать экспрессию белков BRD2, BRD3, BRD4 в клетках HeLa TI и белков BRD3, BRD4 в клетках РМЖ.
Цель исследования – анализ молекулярных механизмов действия CBL на клетки РМЖ in vitro, включая оценку: 1) его цитотоксичности, 2) влияния на клеточный цикл, 3) способности запускать апоптоз, 4) способности вызывать повреждения ДНК, 5) воздействия на экспрессию генов, вовлеченных в процессы пролиферации, апоптоза и репарации.
Материалы и методы. Цитотоксичность CBL в отношении клеток РМЖ (MCF7, MDA-MB-231, SKBR3) оценивали с помощью МТТ-теста. Влияние агента на клеточный цикл и активацию апоптоза анализировали методом проточной цитометрии. Для анализа повреждения ДНК при действии CBL использовали метод ДНК-комет. Изменение экспрессии генов, ассоциированных с пролиферацией, репарацией и апоптозом, оценивали с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Результаты. Концентрации полумаксимального ингибирования (IC₅₀) на клетках РМЖ при действии CBL0137 составили 1 мкМ при 72-часовой экспозиции, 14–25 мкМ – при 24-часовой. кураксин CBL (в концентрациях 0,5 и 1 мкМ) вызывал арест клеточного цикла G2/M, а также запускал апоптоз во всех клеточных линиях. При действии 1 мкМ CBL зарегистрировано повышение степени повреждения ДНК в клетках MCF7 и SKBR3, при действии обеих концентраций – в клетках MDA-MB-231. профиль экспрессии генов, вовлеченных в пролиферацию, также отвечал остановке в G2/M-фазе клеточного цикла. Также при действии CBL происходила активация р53-зависимых генов репарации. Выявлено увеличение экспрессии проапоптотических генов и снижение экспрессии антиапоптотических генов.
Заключение. Кураксин CBL0137 показал различное действие на молекулярные процессы в клетках РМЖ. Мы выявили цитостатический эффект этого соединения, подтвержденный на разных молекулярных уровнях. Полученные данные свидетельствуют о способности CBL ингибировать опухолевые процессы в клетках РМЖ, что делает его потенциальным агентом для комбинационной терапии.

1. Baylin S.B., Jones P.A. Epigenetic determinants of cancer. Cold Spring Harb Perspect Biol 2016;8(9):a019505. DOI: 10.1101/cshperspect.a019505

2. Prabhu K.S., Sadida H.Q., Kuttikrishnan S. et al. Beyond genetics: Exploring the role of epigenetic alterations in breast cancer. Pathol Res Pract 2024;254:155174. DOI: 10.1016/j.prp.2024.155174

3. Thakur C., Qiu Y., Fu Y. et al. Epigenetics and environment in breast cancer: new paradigms for anti-cancer therapies. Front Oncol 2022;12:971288. DOI: 10.3389/fonc.2022.971288

4. Judes G., Dubois L., Rifai K. et al. TIP60: an actor in acetylation of H3K4 and tumor development in breast cancer. Epigenomics 2018;10(11):1415–30. DOI: 10.2217/epi-2018-0004

5. Paydar P., Asadikaram G., Nejad H.Z. et al. Epigenetic modulation of BRCA-1 and MGMT genes, and histones H4 and H3 are associated with breast tumors. J Cell Biochem 2019;120(8):13726–36. DOI: 10.1002/jcb.28645

6. Muller B.M., Jana L, Kasajima A. et al. Differential expression of histone deacetylases HDAC1, 2 and 3 in human breast cancer-over expression of HDAC2 and HDAC3 is associated with clinicopathological indicators of disease progression. BMC Cancer 2013;13:215. DOI: 10.1186/1471-2407-13-215

7. Rifai K., Judes G., Idrissou M. et al. SIRT1-dependent epigenetic regulation of H3 and H4 histone acetylation in human breast cancer. Oncotarget 2018;9(55):30661–78. DOI: 10.18632/oncotarget.25771

8. Aljada A., Saleh A.M., Alkathiri M. et al. Altered sirtuin 7 expression is associated with early stage breast cancer. Breast Cancer (Auckl) 2015;9:3–8. DOI: 10.4137/BCBCR.S23156

9. Pfister S., Rea S., Taipale M. et al. The histone acetyltransferase hMOF is frequently downregulated in primary breast carcinoma and medulloblastoma and constitutes a biomarker for clinical outcome in medulloblastoma. Int J Cancer 2008;122(6):1207–13. DOI: 10.1002/ijc.23283

10. Wang D., Yang P.N., Chen J. et al. Promoter hypermethylation may be an important mechanism of the transcriptional inactivation of ARRDC3, GATA5, and ELP3 in invasive ductal breast carcinoma. Mol Cell Biochem 2014;396(1–2):67–77. DOI: 10.1007/s11010-014-2143-y

11. Xiao X.S., Cai M.Y., Chen J.W. et al. High expression of p300 in human breast cancer correlates with tumor recurrence and predicts adverse prognosis. Chin J Cancer Res 2011;23(3):201–7. DOI: 10.1007/s11670-011-0201-5

12. Sahni J.M., Keri R.A. Targeting bromodomain and extraterminal proteins in breast cancer. Pharmacol Res 2018;129:156–76. DOI: 10.1016/j.phrs.2017.11.015

13. Wu S.Y., Lee C.F., Lai H.T. et al. Opposing functions of BRD4 isoforms in breast cancer. Mol Cell 2020;78(6):1114–32:e10. DOI: 10.1016/j.molcel.2020.04.034

14. Perez-Pena J., Paez R., Nieto-Jimenez C. et al. Mapping Bromodomains in breast cancer and association with clinical outcome. Sci Rep 2019; 9(1):5734. DOI: 10.1038/s41598-019-41934-3

15. Zheng Z.Z., Xia L., Hu G.S. et al. Super-enhancer-controlled positive feedback loop BRD4/ERalpha-RET-ERalpha promotes ERalpha-positive breast cancer. Nucleic Acids Res 2022;50(18):10230–48. DOI: 10.1093/nar/gkac778

16. Murakami S., Li R., Nagari A. et al. Distinct roles for BET family members in estrogen receptor alpha enhancer function and gene regulation in breast cancer cells. Mol Cancer Res 2019;17(12):2356–68. DOI: 10.1158/1541-7786.MCR-19-0393

17. Andrikopoulou A., Liontos M., Koutsoukos K. et al.The emerging role of BET inhibitors in breast cancer. Breast 2020;53:152–63. DOI: 10.1016/j.breast.2020.08.005

18. Ren L., Yang Y., Li W. et al. Recent advances in epigenetic anticancer therapeutics and future perspectives. Front Genet 2022;13:1085391. DOI: 10.3389/fgene.2022.1085391

19. Gasparian A.V., Burkhart C.A., Purmal A.A. et al. Curaxins: anticancer compounds that simultaneously suppress NF-kappaB and activate p53 by targeting FACT. Sci Transl Med 2011;3(95):95ra74. DOI: 10.1126/scitranslmed.3002530

20. Kantidze O.L., Luzhin A.V., Nizovtseva E.V. et al. The anti-cancer drugs curaxins target spatial genome organization. Nat Commun 2019;10(1):1441. DOI: 10.1038/s41467-019-09500-7

21. Kirsanov K., Fetisov T., Lesovaya E.A. et al. Prevention of colorectal carcinogenesis by dna-binding small-molecule curaxin CBL0137 involves suppression of wnt signaling. Cancer Prev Res (Phila) 2020;13(1):53–64. DOI: 10.1158/1940-6207.CAPR-19-0198

22. Leonova K., Safina A., Nesher E. et al. TRAIN (transcription of repeats activates interferon) in response to chromatin destabilization induced by small molecules in mammalian cells. Elife 2018;7:e.30842. DOI: 10.7554/eLife.30842

23. Maksimova V., Popova V., Prus A. et al. Insights into the mechanism of curaxin CBL0137 epigenetic activity: the induction of DNA demethylation and the suppression of BET family proteins. Int J Mol Sci 2023;24(16):12874. DOI: 10.3390/ijms241612874

24. Jin M.Z., Xia B.R., Xu Y., Jin W.L. Curaxin CBL0137 exerts anticancer activity via diverse mechanisms. Front Oncol 2018;8:598. DOI: 10.3389/fonc.2018.00598

25. Fetisov T.I., Borunova A.A., Antipova A.S. et al. Targeting features of curaxin CBL0137 on hematological malignancies in vitro and in vivo. Biomedicines 2023;11(1):230. DOI: 10.3390/biomedicines11010230

26. Lv Y., Du Y., Li K. et al. The FACT-targeted drug CBL0137 enhances the effects of rituximab to inhibit B-cell non-Hodgkin’s lymphoma tumor growth by promoting apoptosis and autophagy. Cell Commun Signal 2023;21(1):16. DOI: 10.1186/s12964-022-01031-x

27. Barone T.A., Burkhart C.A., Safina A. et al. Anticancer drug candidate CBL0137, which inhibits histone chaperone FACT, is efficacious in preclinical orthotopic models of temozolomide-responsive and resistant glioblastoma. Neuro Oncol 2017;19(2):186–96. DOI: 10.1093/neuonc/now141

28. Mo J., Liu F., Sun X. et al. Inhibition of the FACT complex targets aberrant hedgehog signaling and overcomes resistance to smoothened antagonists. Cancer Res 2021;81(11):3105–20. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-20-3186

29. Carter D.R., Murray J., Cheung B.B. et al. Therapeutic targeting of the MYC signal by inhibition of histone chaperone FACT in neuroblastoma. Sci Transl Med 2015;7(312):312ra176. DOI: 10.1126/scitranslmed.aab1803

30. De S., Lindner D.J., Coleman C.J. et al.The FACT inhibitor CBL0137 synergizes with cisplatin in small-cell lung cancer by increasing NOTCH1 expression and targeting tumor-initiating cells. Cancer Res 2018;78(9):2396–406. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-17-1920

31. Burkhart C., Fleyshman D., Kohrn R. et al. Curaxin CBL0137 eradicates drug resistant cancer stem cells and potentiates efficacy of gemcitabine in preclinical models of pancreatic cancer. Oncotarget 2014;5(22):11038–53. DOI: 10.18632/oncotarget.2701

32. Tallman M.M., Zalenski A.A., Deighen A.M. et al. The small molecule drug CBL0137 increases the level of DNA damage and the efficacy of radiotherapy for glioblastoma. Cancer Lett 2021;499:232–42. DOI: 10.1016/j.canlet.2020.11.027

33. Lu X., He Y., Johnston R.L. et al. CBL0137 impairs homologous recombination repair and sensitizes high-grade serous ovarian carcinoma to PARP inhibitors. J Exp Clin Cancer Res 2022;41(1):355. DOI: 10.1186/s13046-022-02570-4

34. Fleyshman D., Prendergast L., Safina A. et al. Level of FACT defines the transcriptional landscape and aggressive phenotype of breast cancer cells. Oncotarget 2017;8(13):20525–42. DOI: 10.18632/oncotarget.15656

35. Khatpe A.S., Dirks R., Bhat-Nakshatri P. et al. TONSL Is an immortalizing oncogene and a therapeutic target in breast cancer. Cancer Res 2023;83(8):1345–60. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-22-3667

36. Song H., Xi S., Chen Y. et al. Histone chaperone FACT complex inhibitor CBL0137 interferes with DNA damage repair and enhances sensitivity of medulloblastoma to chemotherapy and radiation. Cancer Lett 2021;520:201–12. DOI: 10.1016/j.canlet.2021.07.020

37. Plesca D., Mazumder S., Almasan A. DNA damage response and apoptosis. Methods Enzymol 2008;446:107–22. DOI: 10.1016/S0076-6879(08)01606-6

38. Klug W.S., Cummings M.R., Spencer C.A., Palladino M.A. Concepts of genetics. 10 edn. Pearson, 2011.

39. Espinoza J.A., Kanellis D.C., Saproo S. et al. Chromatin damage generated by DNA intercalators leads to degradation of RNA Polymerase II. Nucleic Acids Res 2024;52(8):4151–66. DOI: 10.1093/nar/gkae069

40. Prendergast L., Hong E., Safina A. et al. Histone chaperone FACT is essential to overcome replication stress in mammalian cells. Oncogene 2020;39(28):5124–37. DOI: 10.1038/s41388-020-1346-9

41. Volokh O.I., Sivkina A.L., Moiseenko A.V. et al. Mechanism of curaxin-dependent nucleosome unfolding by FACT. Front Mol Biosci 2022;9:1048117. DOI: 10.3389/fmolb.2022.1048117

42. Nesher E., Safina A., Aljahdali I. et al. Role of Chromatin damage and chromatin trapping of FACT in mediating the anticancer cytotoxicity of DNA-binding small-molecule drugs. Cancer Res 2018;78(6):1431–43. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-17-2690

43. Albahde M.A.H., Zhang P., Chen H., Wang W. CBL0137 administration suppresses human hepatocellular carcinoma cells proliferation and induces apoptosis associated with multiple cell death related proteins. Neoplasma 2020;67(3):547–56. DOI: 10.4149/neo_2020_190621N535

44. Luzhin A., Rajan P., Safina A. et al. Comparison of cell response to chromatin and DNA damage. Nucleic Acids Res 2023;51(21):11836–55. DOI: 10.1093/nar/gkad865

45. Salvador J.M., Brown-Clay J.D., Fornace A.J. Jr. Gadd45 in stress signaling, cell cycle control, and apoptosis. Adv Exp Med Biol 2013;793:1–19. DOI: 10.1007/978-1-4614-8289-5_1

46. Shao S., Wang Y., Jin S. et al. Gadd45a interacts with aurora-A and inhibits its kinase activity. J Biol Chem 2006;281(39):28943–50. DOI: 10.1074/jbc.M600235200