AID/APOBEC family and its role in carcinogenesis

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Исследования, посвященные выяснению роли мутаций в генезе злокачественных новообразований (ЗНО), значительно продвинулись вперед благодаря использованию технологии полногеномного секвенирования; представилась возможность не только обнаруживать ранее неизвестные мутации в кодирующих и некодирующих областях генома, но во многих случаях также определять фактор, вызвавший конкретную мутацию (ультрафиолетовое облучение, компоненты табачного дыма, сбой в работе ферментов, контролирующих целостность ДНК, и др.). Одним из таких факторов, как оказалось, являются клеточные цитидиндезаминазы семейства AID/APOBEC [1, 2].

Целью обзора является анализ современных представлений о роли мутаций, индуцируемых цитидиндезаминазами семейства AID/APOBEC, в генезе ЗНО человека.

СЕМЕЙСТВО AID/APOBEC

Гены группы AID/APOBEC (Activation Induced Deaminase/Apolipoprotein B mRNA Editing enzyme, Catalytic polypeptide-like) кодируют у млекопитающих белки, участвующие как во врожденном, так и в адаптивном (AID) иммунитете. Неоднократно отмечалась парадоксальность их роли – одновременно и препятствовать (быть факторами рестрикции) вирусной инфекции, и способствовать вызванному канцерогенными вирусами онкогенезу [3–5].

Семейство генов AID/APOBEC ответственно за контроль над многими функциями организма в норме и при различных патологиях. Многие кодируемые этими генами Zn-зависимые цитидиндезаминазы связываются как с РНК, так и с однонитевой ДНК, конвертируя цитидин в уридин (рис. 1) [6, 7]. Их способность редактировать клеточные РНК впервые была показана на матричной РНК (мРНК) аполипопротеина B, в которой присутствовала не закодированная в геноме замена C → U. Редактором оказалась цитидиндезаминаза APOBEC1; в результате образования стоп-кодона синтезируется укороченная форма аполипопротеина B, необходимая для транспорта триглицеридов в тонком кишечнике [8, 9].

Рис. 1. Дезаминирование цитидинов. В результате гидролиза аминогруппы (NH₂) в положении 4 дезоксицитидина образуется дезоксиуридин (C>U); процесс происходит под действием APOBEC. В случае успешной репарации образовавшийся уридин может быть возвращен в первоначальное состояние (U>C – левая часть схемы). Если репарация безуспешна, возникшие повреждения далее приводят к транзициям (C>T) или трансверсиям (C>G), которые в следующем цикле репликации фиксируются в виде мутаций (правая часть схемы)

Fig. 1. Deamination of cytidines. The hydrolysis of the amino group (NH₂) at position 4 of deoxycytidine, resulting in the formation of deoxyuridine (C>U), catalyzed by the APOBEC enzyme. The uridine formed after deamination, with efficient repair, can return to its original state (U>C – left part of the scheme). When DNA repair fails, abasic sites are generated, promoting transitions (C>T) and transversions (C>G) that are perpetuated in mutations in the following replication cycle (right part of the scheme)

Предполагается, что семейство AID/APOBEC произошло около 500 млн лет назад от гена AID, экспрессировавшегося в лимфоцитах бесчелюстных рыб, обеспечивая адаптивный иммунитет за счет множественных рекомбинационных событий в генах-рецепторах антигенов [10, 11]. Последующие дупликации и дивергенция генов, возникших из прародительского AID, предположительно, привели к появлению генов, кодирующих цитидиндезаминазы современных позвоночных.

У человека семейство AID/APOBEC представлено 11 генами, кодирующими дезаминазы APOBEC1 (A1), AID, APOBEC2 (A2), APOBEC3A-H (A3A, A3B, A3C, A3D, A3F, A3G и A3H), а также APOBEC4 (A4). О роли этих белков в формировании в ходе эволюции защитных механизмов от ретровирусов и ретротранспозонов свидетельствует тот факт, что, в отличие от приматов, у мыши имеется единственный ген в данном семействе, а количество активных ретроэлементов в геноме мыши в 50–60 раз превосходит их количество у человека [6]. Еще одним фактом, свидетельствующим о жестком отборе в ходе эволюции, стало обнаружение у летучих мышей, являющихся резервуарами и распространителями многих вирусных инфекций, но остающихся толерантными к этим инфекциям, 18 генов в подсемействе APOBEC3, 13 из которых транскрипционно активны [12]. Эволюция этих генов у позвоночных характеризовалась не только изменениями в их количестве, но также накоплением точковых мутаций, приводивших к заменам в белковой молекуле, и преобладанием их над мутациями типа same-sense [13].

Хромосомная локализация этих генов такова: APOBEC1 и AID – 12p13, APOBEC2 – 6p21, все 7 генов подсемейства APOBEC3 – 22q13.1, APOBEC4 – 1q25.3; гены содержат от 2 до 8 экзонов; кодируемые ими белки имеют 1 или 2 (APOBEC3B, APOBEC3DEFG) каталитических дезаминазных домена. Эти гены экспрессируются во многих тканях организма человека, дезаминазы подсемейства APOBEC3 с разной степенью эффективности рестрицируют ретротранспозоны и вирусы. Наиболее подробно среди них изучена APOBEC3G, защищающая организм от вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1) [11].

Функции этих цитидиндезаминаз в организме человека зависят среди прочего от их внутриклеточной локализации. Описаны несколько механизмов, с помощью которых регулируется перемещение белков семейства AID/APOBEC между ядром и цитоплазмой [6]. Локализацию белков подсемейства APOBEC3 в разные моменты митотического цикла исследовали L. Lackey и соавт. [14]. В интерфазе разные представители этого подсемейства характеризовались разнообразием внутриклеточной локализации: по всей клетке, только в цитоплазме или исключительно в ядре. Однако только APOBEC3B по завершении цитокинеза ассоциировалась с ядерной ДНК, что, по мнению авторов, давало этому белку возможность реализовывать функцию мутатора. С учетом результатов проведенной работы и данных, полученных этой группой на клеточных линиях и первичных карциномах молочной железы [15], авторы выделили APOBEC3B как основной фермент, ответственный за индукцию мутаций в ЗНО. В дальнейшем K. Chan и соавт., обнаружив различия в субстратных предпочтениях APOBEC3A и APOBEC3B, указали в дополнение к APOBEC3B и на APOBEC3A как на важный источник мутационных сигнатур в канцерогенезе [16].

В упомянутом выше случае защиты организма человека от ВИЧ-1 находящаяся в цитоплазме клетки дезаминаза APOBEC3G, связываясь с РНК вируса, попадает вместе с ней в вирусный капсид; оказавшись в новой клетке-мишени в составе вирусной частицы, APOBEC3G во время обратной транскрипции модифицирует остатки цитозина в урацил в первой цепи вирусной комплементарной ДНК (кДНК), что в дальнейшем ведет к многочисленным мутациям во второй цепи вирусной ДНК – к появлению стоп-кодонов или к аминокислотным заменам в вирусных белках, снижая тем самым жизнеспособность вируса [17].

У 2 тканеспецифичных представителей семейства APOBEC – APOBEC2 и APOBEC4 – дезаминазная активность выявлена не была. APOBEC2 экспрессируется в сердечной и скелетной мускулатуре и, не обладая активностью дезаминазы ни в отношении ДНК, ни в отношении РНК, взаимодействует с ДНК некоторых промоторов и ингибирует транскрипцию соответствующих генов. Наименее изучены функции APOBEC4. Этот белок экспрессируется в семенниках млекопитающих и, предположительно, является модулятором промоторов [18]. В табл. 1 с небольшими дополнениями представлена информация о представителях семейства AID/APOBEC, обобщенная S. G. Conticello [11].

Таблица 1. Паралоги AID/APOBEC у человека

Table 1. Human AID/APOBEC paralogs

ЦИТИДИНДЕЗАМИНАЗЫ AID/APOBEC В ИММУННОЙ ЗАЩИТЕ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА

Цитидиндезаминазы AID/APOBEC у позвоночных являются важными звеньями иммунитета. AID участвует в адаптивном иммунитете, обеспечивая гипермутабельность генов иммуноглобулинов, а также переключение классов антител [28]. Цитидиндезаминазы подсемейства APOBEC3 обеспечивают механизмы врожденного иммунитета, защищая организм от инфицирования экзогенными РНК- и ДНК-содержащими вирусами, а также ограничивая репликацию эндогенных ретротранспозонов. Противовирусный эффект одного из представителей подсемейства APOBEC3 в отношении ВИЧ-1 был установлен в экспериментах по гибридизации клеток, пермиссивных и непермиссивных для его размножения; вирус в этих опытах был лишен фактора Vif (virus infectivity factor) – белка, важного для поддержания репликации вируса. Конкретный клеточный ген, продукт которого препятствовал размножению ВИЧ-1, был определен как APOBEC3G. Кодируемый им белок в присутствии Vif деградирует [29–31]. После обнаружения у белка APOBEC3G цитидиндезаминазной активности был прояснен механизм дезаминирования вирусной кДНК [32, 33].

Помимо дезаминазазависимого описаны также дезаминазанезависимые механизмы рестрикции ВИЧ-1, которые могут реализовываться с участием каталитически неактивных APOBEC3G и APOBEC3F; в этих случаях цитидиндезаминазы тем или иным способом препятствуют обратной транскрипции – связываются с геномной РНК, взаимодействуют с обратной транскриптазой и т. д. [13].

Противовирусную активность цитидиндезаминазы проявляют в отношении не только ВИЧ-1, но и других экзогенных ретровирусов, а также в отношении эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов. Реализуют эти эффекты кроме APOBEC3G и некоторые другие представители семейства AID/APOBEC. Помимо Vif описаны разнообразные механизмы, с помощью которых осуществляется противодействие вирусов этим защитным системам клетки. Противовирусная функция ферментов данного семейства реализуется также в отношении некоторых ДНК-содержащих вирусов, в частности, вирусов папилломы человека, вируса гепатита B [4, 7, 13].

ЦИТИДИНДЕЗАМИНАЗЫ AID/APOBEC В КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ

Что касается роли цитидиндезаминаз AID/APOBEC в канцерогенезе, то до сравнительно недавнего времени эти работы были ограничены методически: исследователи сосредотачивались на мутациях одного или немногих генов, чаще всего – TP53. В последние десятилетия открылась перспектива изучения генома в целом и фиксации изменений опухолевых геномов, так называемых мутационных сигнатур.

Activation-induced cytidine deaminase (AID) в норме является участником процесса созревания антител: в ходе соматического гипермутирования она индуцирует мутации в парах нуклеотидов C: G в мотивах WRC (где W = A или T; R = A или G). Кластеры мутаций, связанных с активностями AID, часто обнаруживаются в вариабельных областях генов тяжелых цепей иммуноглобулинов в клетках ЗНО, связанных с кроветворной системой, – хронического миелоидного лейкоза, множественной миеломы, диффузных B-крупноклеточных лимфом [9].

Одно из первых сообщений о мутациях в опухолевых геномах, выявленных с помощью методов секвенирования нового поколения, опубликовали L. B. Alexandrov и соавт. [1]. Оперируя информацией из нескольких электронных баз данных, включая Атлас ракового генома (The Cancer Genome Atlas, TCGA), эти авторы проанализировали геномы 30 типов ЗНО, всего 7042 случая, для которых обнаружили более 20 разных мутационных сигнатур, в общей сложности 4 938 362 мутационных события. Некоторые из сигнатур встречались во многих типах новообразований, другие – только в одном. К первой группе были отнесены сигнатуры, вызываемые дезаминазами APOBEC. Эти сигнатуры (так называемые сигнатуры 2 и 13, см. далее) были обнаружены в 16 разных формах новообразований: остром лимфобластном лейкозе, раке мочевого пузыря, молочной железы (РМЖ), шейки матки, хроническом лимфобластном лейкозе, раке пищевода, головы и шеи, почки, плоскоклеточном и аденогенном раке легкого, B-клеточной лимфоме, миеломе, раке поджелудочной железы, желудка, щитовидной железы, матки. Позднее в рамках Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes (PCAWG) Consortium были охарактеризованы сигнатуры в общей сложности для 84 729 690 соматических мутаций из 4645 полногеномных и 19 184 экзомных сиквенсов, охватывавших большинство типов новообразований. Было установлено, что APOBEC-ассоциированные мутации представляют собой один из наиболее распространенных видов мутаций в злокачественных опухолях, они выявлены приблизительно в 75 % типов рака, более чем в 50 % всех новообразований. Сигнатура 2 была обнаружена более чем в 50 % проанализированных опухолевых образцов рака мочевого пузыря, РМЖ, рака шейки матки, пищевода, плоскоклеточного рака головы и шеи, рака почки, печени, плоскоклеточного и аденогенного рака легкого, аденокарцином желудка, рака поджелудочной железы и матки; сигнатура 13 встречалась более чем в 50 % образцов рака мочевого пузыря, РМЖ, рака шейки матки, колоректального рака, рака пищевода, плоскоклеточного рака головы и шеи, плоскоклеточного и аденогенного рака легкого, рака яичников, аденокарцином матки [2].

Детекция APOBEC-ассоциированных мутационных сигнатур при анализе сиквенсов предполагает учет субстрат-специфичности действия каждой из этих дезаминаз. Все представители подсемейства APOBEC3 дезаминируют цитидин, однако имеет место избирательность: динуклеотид 5’-CC является предпочтительной мишенью для APOBEC3G, тогда как APOBEC3A и APOBEC3B предпочтительно дезаминируют цитидин в составе нуклеотида, которому предшествует тимидиловый нуклеотид (5’-TC) [34]. Установлено также, что APOBEC3A предпочтительно дезаминирует цитидин, если мотиву 5’-TC предшествует пиримидин, а APOBEC3B – в случаях, когда предшественником является пурин [16].

По мере увеличения количества просеквенированных опухолей были выявлены 2 мутационные сигнатуры, связанные с дезаминирующим действием APOBEC: «сигнатура 1» и «сигнатура 2»; их обозначают также как SBS1 и SBS2 (от single base substitution) или «сигнатура 2» и «сигнатура 13». Это транзиции C>T и трансверсии C>G и C>A соответственно. Конкретная мутация, инициированная актом дезаминирования, возникает в результате процессов репликации и репарации [35]. В отдельных новообразованиях эти сигнатуры встречаются обычно совместно, хотя их соотношение может значительно варьировать [1, 2].

Помимо рассеянных по геному APOBEC-ассоциированных мутаций в опухолях описаны также кластеры нуклеотидных замен в парах C: G, возникшие на одной нити ДНК и получившие название катаэгис (kataegis, греч. καταιγίς – шторм, мутационный душ); катаэгис определяется как 6 или более мутаций, где соседние мутации отстоят друг от друга не более чем на 1000 п. н.; он нередко колокализуется с областями хромосомных перестроек [1, 35, 36]. Мишени, которые предпочитают APOBEC3A и APOBEC3B, различаются не только по последовательности нуклеотидов вокруг дезаминируемого основания, но и по вторичной структуре ДНК в этой области. Так, APOBEC3A проявляет дезаминазную активность в отношении шпилек в ДНК (DNA hairpin loops), и в составе этих шпилек вторичная структура может «пересиливать» (override) первичную, – APOBEC3A способна дезаминировать в этих случаях цитидин в сайтах VpC (где V – любое основание кроме T: GpC, ApC, CpC) [37, 38]. Эти данные расширили представление об APOBEC3A-специфичных мутационных сигнатурах: ранее VpC-сайты рассматривались как мишени при возрастном мутагенезе [1]. A. Sanchez и соавт. показали, что и APOBEC3B реализует свою цитидиндезаминазную активность преимущественно в отношении цитидина, находящегося в составе шпилечных структур, но эти структуры отличаются от шпилек, цитидин в составе которых предпочитает APOBEC3A: они состоят из 5 нуклеотидов (а в случае APOBEC3A – из 3) [39]. Было сделано заключение, что в составе геномов опухолевых клеток дезаминазы APOBEC3A и APOBEC3B вызывают мутации в разных сайтах – каждая из них обладает избирательностью в отношении субстрата; в совокупности они могут генерировать разные мутационные ландшафты в опухолевых геномах.

Ответ на вопрос, какой именно фермент из APOBEC3 – APOBEC3A или APOBEC3B – является главным генератором мутаций в опухолевых клетках, важен как для понимания механизмов прогрессии новообразований, так и для того, чтобы определить перспективную мишень для химиотерапии. Этому вопросу посвящена работа M. Petljak и соавт., создавших клеточные линии РМЖ, мочевого пузыря и лимфомы (в общей сложности 251 линию), из которых удалили гены APOBEC3A и APOBEC3B [40]. Линии неоднократно клонировали, отделяя мутационные сигнатуры, возникшие после нокаута соответствующего гена, от предсуществовавших. Использовали полногеномное секвенирование. Было установлено, что делеция APOBEC3A приводила к уменьшению количества APOBEC-специфичных сигнатур; совместная делеция APOBEC3A и APOBEC3B дополнительно снижала количество этих сигнатур, но не приводила к их полному исчезновению; кроме того, делеция APOBEC3B вызывала повышение содержания белка APOBEC3A, а также повышение его активности в ряде клеточных линий. Совокупность этих результатов свидетельствовала, что эндогенные APOBEC3-дезаминазы генерируют основную часть мутационных сигнатур в раковых клетках человека; APOBEC3A является главным драйвером этих мутаций; APOBEC3B тоже вносит свой вклад, но меньший, в этот процесс.

Для прояснения роли в канцерогенезе индивидуальных членов подсемейства APOBEC3 представляют интерес случаи генеративной делеции в 22q13.1, где локализованы гены подсемейства APOBEC3. J. M. Kidd и соавт. в популяционно-генетическом исследовании показали, что распространенная среди людей делеция в хромосоме 22 (в среднем она обнаруживается у 22,5 % индивидуумов) размером 29,5 кб в разных регионах мира встречается с сильно варьирующей частотой: в Африке и Европе – редко, в 0,9 и 6 % случаев соответственно; в Восточной Азии и среди американских индейцев чаще – в 36,9 и 56,7 % соответственно, и с очень высокой постоянной частотой среди аборигенов Океании – в 92,9 % случаев [41]. При этой делеции утрачивается генетический материал между 5-м экзоном APOBEC3A и 8-м экзоном APOBEC3B, в результате возникает гибридный транскрипт, а при трансляции возникает белок, по аминокислотной последовательности идентичный APOBEC3A; APOBEC3B и соответствующий белок утрачиваются (рис. 2).

Рис. 2. Структура делеции APOBEC3A_B

Fig. 2. Structure of the APOBEC3A_B deletion

В исследовании D. Xuang и соавт., выполненном по схеме случай–контроль, включавшем 1671 пациентку с карциномами молочной железы и 1602 здоровые женщины, изучалось влияние этой делеции на риск возникновения опухоли. Делецию APOBEC3 авторы обнаружили у 12,4 % больных и 10,4 % женщин контрольной группы. Риск развития РМЖ значимо возрастал в случае делеции: отношение шансов (ОШ) в случае утраты 1 копии составило 1,21 (1,02–1,43) при 95 % доверительном интервале, а в случае утраты 2 копий – 2,29 (1,04–5,06) [42]. APOBEC-ассоциированные мутационные сигнатуры 2 и 13 в РМЖ у женщин-носителей делеции обнаруживались чаще, чем в карциномах тех пациенток, у которых делеция отсутствовала [43]. Наиболее вероятным объяснением того, что у женщин-носительниц делеции риск возникновения РМЖ возрастал, является изменение у таких пациенток посттранскрипционной регуляции APOBEC3A, проявляющееся в многократном повышении у них стабильности соответствующего транскрипта вследствие утраты нескольких сайтов связывания с малыми интерферирующими РНК (миРНК), ингибирующими данный ген-мутатор в присутствии интактного APOBEC3B [5].

Ассоциация наличия рассматриваемой делеции с увеличением частоты заболеваемости РМЖ была выявлена помимо китайских женщин у иранских и малазийских женщин; вместе с тем в ряде стран (Швеция, Индия, Марокко) она не подтвердилась [5]. Очевидно, что помимо полиморфизма популяций по данной делеции на частоту заболеваемости РМЖ влияют иные этнические особенности, которые прояснятся в ходе дальнейших исследований.

Совместное участие APOBEC3A и APOBEC3B в возникновении большинства мутационных сигнатур в опухолевых клетках человека in vitro и в первичных опухолях молочной железы in vivo подтвердили M. A. Carpenter и соавт. [44].

В течение ряда лет господствующей среди исследователей была точка зрения, впоследствии уточненная, что главным генератором мутаций в клетках ЗНО является APOBEC3B; основанием для нее явились результаты исследования M. B. Burns и соавт. [15].

M.B. Burns и соавт. изучили экспрессию всех 11 представителей семейства AID/APOBEC в количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в 38 клеточных линиях РМЖ; гиперэкспрессировался только APOBEC3B: в 28 из 38 линий – на ≥3 s.d., а в 12 линиях – на ≥10 s.d относительно соответствующих контролей (s.d. – standard deviation, стандартное отклонение). Ядерные фракции этих клеточных линий обладали дезаминазной активностью в отношении TC-динуклеотидов, при введении коммерческого препарата shRNA к APOBEC3B наблюдался нокдаун, что коррелировало со снижением содержания урацила в геноме и уменьшением частоты транзиций C → T. Продолжив исследование на 52 образцах первичного РМЖ и условно-нормальных (контрольных) тканях от этих больных, авторы зафиксировали в 20 из опухолевых образцов усиление экспрессии APOBEC3B на ≥3 s.d. Данные из электронных баз, свидетельствовавшие о положительной корреляции между уровнем экспрессии APOBEC3B, мутационной нагрузкой от замен C → T и инактивацией TP53, позволили авторам сделать заключение о том, что APOBEC3B – важный источник мутаций в РМЖ.

О положительной корреляции транскрипционной активности APOBEC3B с количеством мутационных сигнатур, а также с рядом клинических характеристик ЗНО сообщили несколько исследовательских групп [45–47].

Позднее L. M. Cortez и соавт. принципиально уточнили результаты M. B. Burns и соавт. [48]. На 28 клеточных линиях РМЖ, используя данные полноэкзомного секвенирования и количественной ОТ-ПЦР, L. M. Cortez и соавт. показали, что в присутствии клеточной РНК (при постановке тестов без РНКазы А) APOBEC3A обладала цитидиндезаминазной активностью, более чем в 100 раз превосходившей активность APOBEC3B. Следовательно, более выраженная экспрессия APOBEC3B по сравнению с APOBEC3A была ответственна за индукцию мутаций в клетках РМЖ в меньшей степени, нежели экспрессия APOBEC3A. Эти различия между APOBEC3A и APOBEC3B в проявлении ими цитидиндезаминазной активности были обусловлены небольшими структурными особенностями строения N-концевого домена молекул, благодаря которым APOBEC3B, в отличие от APOBEC3A, обладает способностью связываться с однонитевой РНК. L. M. Cortez и соавт. пришли к выводу, что именно APOBEC3A является главным источником цитидиндезаминазой активности в клетках РМЖ и, по-видимому, главным генератором APOBEC-специфичных мутационных сигнатур. Оказалось также, что короткая РНК, образующая шпильку (shRNA), с помощью которой M. B. Burns и соавт. вызывали нокдаун APOBEC3B, неспецифично многократно (в 4–14 раз) угнетала также транскрипцию APOBEC3A.

Продолжив исследование на 229 образцах первичного РМЖ, L. M. Cortez и соавт. показали вовлеченность в мутагенез в этих карциномах как APOBEC3A, так и APOBEC3B, но при большей роли APOBEC3A. Достоверную корреляцию между уровнями экспрессии обеих цитидиндезаминаз и количеством APOBEC-специфичных мутаций они зафиксировали также для опухолей других локализаций, охарактеризованных в TCGA: для 410 образцов рака мочевого пузыря, 197 образцов рака шейки матки и 549 случаев рака головы и шеи. В образцах рака шейки матки уровень экспрессии APOBEC3A лучше коррелировал с количеством мутаций, чем уровень экспрессии APOBEC3B; в случае рака мочевого пузыря, напротив, с количеством APOBEC-специфичных мутаций коррелировал только уровень экспрессии APOBEC3B. Итак, определив APOBEC3A как основной генератор мутаций в РМЖ и других карциномах, L. M. Cortez и соавт. показали, что некоторую роль в возникновении APOBEC-специфичных мутаций играет также APOBEC3B и что в разных опухолях активность этих цитидиндезаминаз может варьировать.

APOBEC-АССОЦИИРОВАННЫЕ МУТАЦИОННЫЕ СИГНАТУРЫ И ПОПЫТКИ ОБНАРУЖЕНИЯ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ-ДРАЙВЕРАХ И СУПРЕССОРАХ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА

Тот факт, что дезаминазная активность ферментов группы APOBEC реализуется только на однонитевой ДНК, давал повод допускать, что гены, мутации в которых являются драйверами или супрессорами канцерогенеза, могут избежать воздействия этих мутаторов. S. A. Roberts и соавт. проверили, вовлекаются ли драйверные гены в мутационный процесс, индуцируемый этими белками [49]. Результаты полногеномного и полноэкзомного секвенирования для 14 разных типов опухолей, в общей сложности для 2680 новообразований, позволили выявить 954 247 APOBEC-специфичных мутаций из TCGA и из ряда отдельных исследований. В 6 типах новообразований (раке шейки матки, головы и шеи, мочевого пузыря, РМЖ, плоскоклеточном и аденогенном раке легкого) такие мутации в некоторых образцах составляли до 68 % всех выявленных мутаций. Авторы обнаружили четкую корреляцию повышенной частоты APOBEC-индуцированных мутаций и с уровнями мРНК APOBEC3B, APOBEC3A и APOBEC3H; уровень экспрессии генов оценивали, сравнивая с показателями для соответствующих нормальных тканей. Далее был проведен анализ того, как перекрываются APOBEC-специфичные мутации и мутации в генах – потенциальных драйверах опухолевого роста. Драйверные гены идентифицировали с помощью одного из трех источников: 1) электронной базы данных CRAVAT [50], 2) электронной базы данных COSMIC [51] и 3) перечня генов из The Cancer Gene Census [52]. APOBEC-специфичные мутационные сигнатуры в генах-драйверах опухолевого роста встречались среди канцерогенных мутаций с более высокой частотой именно в тех опухолевых образцах, для которых в целом была установлена высокая частота APOBEC-специфичных мутаций по сравнению с теми, где APOBEC-специфичные мутации не обнаруживались. Результаты работы свидетельствовали, что APOBEC-специфичные мутации могут вносить лепту в канцерогенез там, где вызванных APOBEC мутаций много.

Что касается APOBEC-специфичных мутаций в генах-супрессорах опухолевого роста, то имеется сообщение о достоверном учащении таких мутаций, ассоциированных с APOBEC3A, в TP53 при раке легкого у курильщиков [53].

APOBEC-СПЕЦИФИЧНЫЕ МУТАЦИОННЫЕ СИГНАТУРЫ И КЛИНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ОПУХОЛЕЙ

Обнаружена связь между такими характеристиками ЗНО, как развитие резистентности к таргетным препаратам, способность к метастазированию, общая выживаемость больных, и APOBEC-специфичными мутациями в их клетках [46, 47, 54, 55].

В работе на немелкоклеточном раке легкого H. Isozaki и соавт., используя полногеномное и полноэкзомное секвенирование, показали in vivo и in vitro, что лечение часто используемыми в клинической практике таргетными препаратами вызывает индукцию экспрессии APOBEC3A, но не других APOBEC, в тех клетках опухоли, которые переживают химиотерапевтические воздействия [54]. Индуцированная терапией APOBEC3A стимулирует образование двунитевых разрывов ДНК и геномную нестабильность в виде мутационных сигнатур 2 и 13 в этих клетках. Так, в опухоли от больного, прошедшего лечение последовательно несколькими ингибиторами тирозинкиназ, APOBEC-специфичные сигнатуры составили 73,9–93,5 %, тогда как до лечения они выявлялись с частотой 5,5 %. Экспериментальная делеция APOBEC3A вела к снижению частоты APOBEC3A-специфичных мутационных сигнатур и структурных перестроек генома, при этом замедлялось наступление резистентности к таргетной терапии. Индукция APOBEC3A под действием таргетных препаратов происходила при участии транскрипционного ядерного фактора κB (NFκB). Показав, что индукция APOBEC3A под действием таргетной терапии ведет к эволюции переживших это воздействие опухолевых клеток, авторы предположили, что подавление экспрессии APOBEC3A или активности соответствующего фермента может стать способом предупреждения или отсрочки резистентности немелкоклеточного рака легкого к таргетным препаратам.

Сходные результаты опубликовали N. M. G. Garcia и соавт., наблюдавшие значительное усиление экспрессии APOBEC3A и APOBEC3B под действием ингибиторов рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), что приводило к увеличению выживаемости клеток немелкоклеточного рака легкого после лечения этими ингибиторами [55].

Сочетание эффектов эндогенного (APOBECs) и экзогенного (табачный дым) мутагенов в случае рака легкого исследовали T. Zhang и соавт. [53]. На материалах от 309 курящих больных этой формой рака по результатам полногеномного и транскриптомного анализов они выделили группы с высоким и низким уровнями APOBEC-специфичных мутационных сигнатур. Оказалось, что у больных 1-й группы, у которых в раковых клетках преобладали APOBEC3A-специфичные сигнатуры, начало развития рака фиксировалось достоверно позже, и клональная экспансия у них шла медленнее, чем у больных 2-й группы, где в клетках опухоли преобладали APOBEC3B-индуцированные сигнатуры. Эти результаты указывают на важность продолжения изучения комбинированных воздействий разных мутагенов при развитии злокачественных опухолей.

Результаты исследования M. Tsuboi и соавт. свидетельствовали о том, что уровень экспрессии APOBEC3B может служить индикатором агрессивности РМЖ [46]. Авторы использовали операционный материал от 93 больных с первичными опухолями, а также нормальную ткань молочной железы от 37 из этих больных; экспрессию APOBEC3B оценивали в ОТ-ПЦР в реальном времени; транскрипционную активность других APOBEC не исследовали. Оказалось, что по сравнению с нормальными тканями молочной железы в опухолях имела место гиперэкспрессия APOBEC3B; она коррелировала с метастазами опухолей в лимфатических узлах, а также со степенью патологии клеточных ядер (pathological nuclear grade).

Транскрипционная активность APOBEC3B в отдаленных метастазах РМЖ была достоверно выше, чем в первичных опухолях; для метастазов в регионарных лимфатических узлах различий обнаружено не было [47]. Анти-APOBEC3B-терапия, по мнению этих исследователей, может оказаться перспективной при лечении поздних стадий РМЖ.

Рак мочевого пузыря, как и рак легкого и РМЖ, принадлежит к числу злокачественных опухолей, во многих из которых APOBEC-специфичные мутационные сигнатуры обнаруживаются с высокой частотой [1, 2]. A. P. Glaser и соавт. изучили общую выживаемость больных раком мочевого пузыря, используя несколько баз данных, в том числе TCGA. Опухоли разбили на 2 группы: с высоким содержанием APOBEC-специфичных сигнатур (324 случая) и с низким их содержанием (64 случая) [56]. Общая выживаемость пациентов с опухолями 1-й группы оказалась достоверно выше, чем общая выживаемость пациентов с опухолями 2-й группы (38,2 мес по сравнению с 18,5 мес; p = 0,005). Опухоли 1-й группы часто содержали мутации в генах, реагирующих на повреждение ДНК (TP53, ATR, BRCA2), а также в генах, регулирующих состояние хроматина (ARID1A, MLL, MLL3), тогда как в опухолях 2-й группы мутации чаще затрагивали онкогены (FGFR3, KRAS). Экспрессия APOBEC 3A и APOBEC3B коррелировала с мутационной нагрузкой в раке мочевого пузыря независимо от молекулярного подтипа опухолей. Опухоли 1-й группы, в отличие от опухолей 2-й группы, характеризовались повышенной экспрессией многочисленных генов, ответственных за иммунную защиту. Итак, дезаминазы APOBEC, обусловливая появление новых эпитопов в опухолевых клетках и иммунный ответ на эти клетки, в случае рака мочевого пузыря улучшают прогноз заболевания.

Факты, свидетельствующие о вероятном участии APOBEC-ассоциированных мутационных сигнатур в приобретении злокачественными опухолями большей гетерогенности клеток, резистентности к химиотерапевтическим препаратам, а также способности к метастазированию, позволили выдвинуть на первый план вопрос о целесообразности искусственного ингибирования этих ферментов у онкологических больных [47, 54]. Разработки в данном направлении ведутся, однако ряд обстоятельств служит предупреждением о недостаточной обоснованности и преждевременности таких попыток. Так, M. Petljak и соавт. отмечают, что механизмы регуляции этих ферментов в нормальных и опухолевых тканях изучены недостаточно и побочные эффекты от их искусственного подавления неочевидны; предсказания последствий от воздействия на определенную цитидиндезаминазу в конкретном типе опухоли противоречивы из-за недостатка наблюдений [57]. Эти авторы не исключают, что, напротив, активация этих мутаторов в опухолях при современном уровне знаний в данной области может приводить к благоприятному терапевтическому результату благодаря индукции гибели опухолевых клеток, приобретших повреждения ДНК с участием APOBEC3, или благодаря появлению в опухолевых клетках новых эпитопов, что повысит эффективность иммунотерапии. Высказано предположение о возможной результативности использования APOBEC-специфичных мутационных сигнатур в качестве предиктивных маркеров ответа на ингибиторы иммунных чекпойнтов в химиотерапии РМЖ [58].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

APOBEC-ассоциированные мутации представляют собой один из наиболее распространенных видов мутаций в ЗНО, они выявлены приблизительно в 75 % типов опухолей, более чем в 50 % всех новообразований. Основными генераторами мутаций в опухолевых клетках являются цитидиндезаминазы APOBEC3A и APOBEC3B. Оба эти фермента предпочтительно дезаминируют цитидин в составе нуклеотида, которому предшествует тимидиловый нуклеотид (5’-TC), при этом APOBEC3A дезаминирует цитидин, если мотиву 5’-TC предшествует пиримидин, а APOBEC3B – в случаях, когда предшественником является пурин. В РМЖ большинство APOBEC-специфичных мутационных сигнатур вызваны APOBEC3A; вместе с тем в опухолях разных локализаций активность этих цитидиндезаминаз может варьировать. В ЗНО, в которых APOBEC-специфичных мутаций много, эти мутации, по-видимому, могут вносить лепту в канцерогенез. Установлена связь между некоторыми клиническими характеристиками ЗНО, такими как развитие резистентности к таргетным препаратам, способность к метастазированию, общая выживаемость больных, и имеющимися в их клетках APOBEC-специфичными мутационными сигнатурами.

Имеются основания ожидать новых открытий в этой области, учитывая большой интерес исследователей к семейству AID/APOBEC. Двумя направлениями, на которых это произойдет, представляются, во-первых, прояснение участия представителей этого семейства в генезе распространенных форм рака (молочной и предстательной желез, легкого и др.) совместно с онкогенными вирусами, включая вирус папилломы человека, и, во-вторых, анализ перспективности искусственного воздействия на экспрессию этих белков для лечения онкологических больных.

About the authors

G. M. Volgareva

Author for correspondence.
Email: galina.volgareva@ronc.ru
ORCID iD: 0000-0002-6817-2103
Russian Federation, 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115522

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Deamination of cytidines. The hydrolysis of the amino group (NH2) at position 4 of deoxycytidine, resulting in the formation of deoxyuridine (C>U), catalyzed by the APOBEC enzyme. The uridine formed after deamination, with efficient repair, can return to its original state (U>C – left part of the scheme). When DNA repair fails, abasic sites are generated, promoting transitions (C>T) and transversions (C>G) that are perpetuated in mutations in the following replication cycle (right part of the scheme)

Download (133KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Structure of the APOBEC3A_B deletion

Download (131KB)

Indexing metadata