Роль остатка пролина Р325 в распознавании эпитопа MX35 натрийзависимого фосфатного транспортера NaPi2b моноклональными антителами в клетках карциномы яичника

Введение. Одним из ключевых компонентов клеточных мембран являются мембранные белки, обеспечивающие широкий спектр функций – от транспорта и передачи сигналов до координации межклеточных взаимодействий. Среди них особый интерес представляет натрийзависимый фосфатный транспортер NaPi2b, играющий большую роль в поддержании гомеостаза фосфатов и содержащийся в большом количестве в ряде опухолевых клеток. В состав большого внеклеточного домена (ВКД) NaPi2b входит эпитоп MX35, который представляет значительный интерес в контексте разработки моноклональных антител для таргетной терапии карциномы яичника и легкого. Рас познавание эпитопа MX35 зависит от конформации большого ВкД, обусловленной дисульфидными связями и гликозилированием. Между двумя остатками цистеина – С322 и С328 – находится остаток пролина P325, который, как мы предполагаем, может участвовать в формировании конформации большого ВКД NaPi2b посредством образования дисульфидной связи С322–С328, влияющей на взаимодействие моноклональных антител и эпитопа MX35.

Цель исследования – изучение влияния остатка пролина в положении 325 в области большого ВКД транспортера NaPi2b на взаимодействие моноклональных антител L3(28/1) с эпитопом MX35.

Материалы и методы. В исследовании использованы клеточные линии эпителиальной карциномы яичника чело века OVCAR-8 и OVCAR-4. путем сайт-направленного мутагенеза остаток пролина P325 NaPi2b заменили на остаток аланина, в результате чего были получены клетки OVCAR-8, стабильно экспрессирующие мутантный вариант NaPi2bp.P325A. С помощью вестерн-блот-анализа и лазерной конфокальной микроскопии изучено влияние замены p.P325A NaPi2b на взаимодействие моноклональных антител L3(28/1) и эпитопа МХ35. Для определения влияния мутации p.P325A на формирование дисульфидных связей в большом ВКД NaPi2b проводили модификацию тиоловых групп остатков цистеина с использованием малеимидсодержащих соединений.

Результаты. Выявлено, что замена p.P325A NaPi2b не оказывает значительного влияния на распознавание эпитопа MX35 антителами L3(28/1) как при вестерн-блот-анализе, так и при конфокальной микроскопии. количество дисульфидных связей в большом ВКД NaPi2bp.P325A не менялось по сравнению с NaPi2b дикого типа.

Заключение. Замена p.P325A транспортера NaPi2b не оказывает значимого влияния на распознавание эпитопа MX35 антителами и формирование дисульфидных связей в большом ВКД NaPi2b. Дальнейшие исследования могут быть направлены на более детальное изучение роли других замен в большом ВКД NaPi2b и их влияния на доступность эпитопа для антител.

1. Guo L., Wang S., Li M., Cao Z. Accurate classification of membrane protein types based on sequence and evolutionary information using deep learning. BMC Bioinformatics 2019;20:1–17. DOI: 10.1186/s12859-019-3275-6

2. Krogh A., Larsson B., Von Heijne G., Sonnhammer E.L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. J Mol Biol 2001;305(3):567–80. DOI: 10.1006/jmbi.2000.4315

3. Overington J.P., Al-Lazikani B., Hopkins A.L. How many drug targets are there? Nat Rev Drug Discov 2006;5(12):993–6. DOI: 10.1038/nrd2199

4. Forster I.C. The molecular mechanism of SLC34 proteins: insights from two decades of transport assays and structure-function studies. Pflügers Arch 2019;471(Pt 2):15–42. DOI: 10.1007/s00424-018-2207-z

5. Bulatova L., Savenkova D., Nurgalieva A. et al. Toward a topology based therapeutic design of membrane proteins: validation of NaPi2b topology in live ovarian cancer cells. Front Mol Biosci 2022;9:895911. DOI: 10.3389/fmolb.2022.895911

6. Vlasenkova R., Nurgalieva A., Akberova N. et al. Characterization of SLC34A2 as a potential prognostic marker of oncological diseases. Biomolecules 2021;11(12):1878. DOI: 10.3390/biom11121878

7. Soares I.C., Simões K., de Souza J.E.S. et al. In silico analysis and immunohistochemical characterization of NaPi2b protein expression in ovarian carcinoma with monoclonal antibody MX35. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2012;20(2):165–72. DOI: 10.1097/pai.0b013e318228e232

8. Kiyamova R., Shyian M., Lyzogubov V.V. et al. Immunohistochemical analysis of NaPi2b protein (MX35 antigen) expression and subcellular localization in human normal and cancer tissues. Exp Oncol 2011;33(3):157–61.

9. Gryshkova V., Goncharuk I., Gurtovyy V. et al. The study of phosphate transporter NaPi2b expression in different histological types of epithelial ovarian cancer. Exp Oncol 2009;31(1):37–42.

10. Rangel L.B.A., Sherman-Baust C.A., Wernyj R.P. et al. Characterization of novel human ovarian cancer-specific transcripts (HOSTs) identified by serial analysis of gene expression. Oncogene 2003;22(46):7225–32. DOI: 10.1038/sj.onc.1207008

11. Yin B.W.T., Kiyamova R., Chua R. et al. Monoclonal antibody MX35 detects the membrane transporter NaPi2b (SLC34A2) in human carcinomas. Cancer Immun 2008;8:3.

12. Horsley E., Jabeen A., Veillard N. et al. Preclinical development of NaPi2b-PL2202, a novel camptothecin-based antibody-drug conjugate targeting solid tumors expressing NaPi2b. Cancer Res 2024;84(6_Suppl):5085. DOI: 10.1158/1538-7445.AM2024-5085

13. Fessler S., Dirksen A., Collins S.D. et al. XMT-1592, a site-specific dolasynthen-based NaPi2b-targeted antibody-drug conjugate for the treatment of ovarian cancer and lung adenocarcinoma. Cancer Res 2020;80(16_Suppl):2894. DOI: 10.1158/1538-7445.am2020-2894

14. Kiyamova R., Minigulova L.F., Skripova V. et al. N-glycosylation status of membrane phosphate transporter NaPi2b is crucial for its epitope recognition by monoclonal antibody in tumour cells. Ann Oncol 2020;31(5):S1227–8. DOI: 10.1016/j.annonc.2020.08.2193

15. Коротаева А.В., Булатова Л.Ф., Власенкова Р.А., Киямова Р.Г. Распознавание Na-зависимого фосфатного транспортера NaPi2b моноклональными антителами в клетках бактерий и эукариот. Биотехнология 2022;38(5):66–72.

16. Минигулова Л.Ф., Скрипова В.С., Нургалиева А.К. и др. Распознавание натрийзависимого фосфатного транспортера NaPi2b моноклональными антителами N-NaPi2b в клетках карциномы яичника. Ученые записки Казанского университета 2020;162(4):529–40. DOI: 10.26907/2542-064X.2020.4.529-540

17. Gryshkova V., Lituiev D., Savinska L. et al. Generation of monoclonal antibodies against tumor-associated antigen MX35 sodium-dependent phosphate transporter NaPi2b. Hybridoma (Larchmt) 2011;30(1):37–42. DOI: 10.1089/hyb.2010.0064

18. Bulatova L.F., Skripova V.S., Nurgalieva A.K. et al. Structurally constrained tumor-specific epitope within the largest extracellular domain of sodium-dependent phosphate transporter NaPi2b. Ann Oncol 2021;32(5):S368–9. DOI: 10.1016/j.annonc.2021.08.304

19. Булатова Л.Ф., Скрипова В.С., Коротаева А.В. и др. Распознавание мутантных форм натрийзависимого фосфатного транс портера NaPi2b моноклональными антителами в клетках рака яичника. Казанский медицинский журнал 2022;103(4):608–16. DOI: 10.17816/KMJ2022-608

20. Nadeau V.G., Deber C.M. Structural impact of proline mutations in the loop region of an ancestral membrane protein. Biopolymers 2016;106(1):37–42. DOI: 10.1002/bip.22765

21. Kiyamova R., Gryshkova V., Ovcharenko G. et al. Development of monoclonal antibodies specific for the human sodium-dependent phosphate co-transporter NaPi2b. Hybridoma 2008;27(4):277–84. DOI: 10.1089/hyb.2008.0015

22. Boichuk S., Dunaev P., Skripova V. et al. Unraveling the mechanisms of sensitivity to anti-FGF therapies in imatinib resistant gastrointestinal stromal tumors (GIST) lacking secondary KIT mutations. Cancers (Basel) 2023;15(22):5354. DOI: 10.3390/cancers15225354.

23. McKinnon L.J., Fukushima J., Endow J.K. et al. Membrane chaperoning of a thylakoid protease whose structural stability is modified by the protonmotive force. Plant Cell 2020;32(5):1589–609. DOI: 10.1105/tpc.19.00797

24. Krieger F., Möglich A., Kiefhaber T. Effect of proline and glycine residues on dynamics and barriers of loop formation in polypeptide chains. J Am Chem Soc 2005;127(10):3346–52. DOI: 10.1021/ja042798i

25. Schmitt S., Mai I., Machui P. et al. TUB-040, a novel Napi2b targeting ADC built with ethynylphosphonamidate conjugation chemistry, demonstrates high and long-lasting anti-tumor efficacy via Topoisomerase-I inhibition and excellent tolerability predictive of a wide therapeutic window in humans. Cancer Res 2024; 84(6_Suppl):2622. DOI: 10.1158/1538-7445.AM2024-2622

26. Gryshkova V.S., Filonenko V.V., Kiyamova R.G. Inhibition of sodium-dependent phosphate transporter NaPi2b function with MX35 antibody. Biopolym Cell 2011;27:193–8. DOI: 10.7124/bc.0000B9