Regulatory T cells in the primary tumor growth lesion in colorectal cancer

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Колоректальный рак (КРР) по распространенности занимает 3-е место среди всех злокачественных новообразований и 2-е – по смертности [1]. В последние годы прорыв в лечении КРР связывают с иммунотерапией. Современные методы иммунотерапии направлены как на коингибирующие и костимулирующие рецепторы иммунной системы, так и на отдельные популяции иммунных клеток [2]. В этом контексте особый интерес представляют регуляторные Т-клетки (Т-рег), которые обладают проонкогенной активностью, ингибируют иммунный ответ и поэтому могут быть значимой мишенью для иммунотерапевтических методов лечения КРР [3]. Клетки данного типа играют ключевую роль в ограничении аутоиммунных реакций, а также в механизмах канцерогенеза [4]. Известно, что Т-рег подавляют цитотоксическую активность CD8-положительных лимфоцитов и экспрессируют фактор транскрипции forkhead box p3 (Foxp3), который определяет ингибирующую активность T-рег [5]. Иммуносупрессивная активность T-рег обусловлена секрецией клеточных медиаторов (интерлейкина (IL) 10, трансформирующего фактора роста β (TGF-β) и IL-35), использованием иммунных контрольных точек (CTLA-4 и LAG-3), эктоферментов (CD39 и CD73), а также аденозина [6, 7].

В настоящее время роль T-рег в механизмах канцерогенеза, изменение содержания подтипов данных иммунных клеток в опухолевой ткани, а также участие коингибирующих и костимулирующих белков иммунной системы в формировании опухолевой иммуносупрессии при раке толстой кишки изучены недостаточно. T-рег следует рассматривать как перспективные клетки-мишени в стратегии иммунотерапии КРР.

Цель исследования – определить содержание подтипов Т-рег в первичном очаге опухолевого роста у больных раком толстой кишки и оценить уровень экспрессии костимулирующих и коингибирующих белков на их мембране.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование вошли 180 больных, которые были разделены на 2 группы. В основную группу включены 105 пациентов с аденокарциномой толстой кишки III стадии, в контрольную – 75 пациентов с неопухолевыми заболеваниями ободочной кишки. Группы сопоставимы по полу и возрасту больных.

Характеристика пациентов, вошедших в исследование, представлена в табл. 1.

 

 

Таблица 1. Характеристика пациентов, включенных в иссследование

Table 1. Characteristics of patients included in the study

Показатель Parameter	Основная группа (n = 105) Main group (n = 105)	Контрольная группа (n = 75) Control group (n = 75)	Результаты статистического анализа Statistical analysis results
Критерии включения Inclusion сriteria	Верифицированный колоректальный рак, первичный статус заболевания Verified colorectal cancer, primary disease status	Неопухолевые заболевания толстой кишки (колостома, неосложненные дивертикулы, долихоколон, травма кишки без перитонита) Non-neoplastic diseases of the colon (colostomy, uncomplicated diverticula, dolichocolon, bowel trauma without peritonitis)	–
Критерии исключения Exclusion criteria	Лучевая терапия или химиотерапия, аутоиммунные и инфекционные заболевания, воспалительные заболевания толстой кишки Radiation therapyor chemotherapy, autoimmune and infectious diseases, inflammatory bowel disease	Злокачественные новообразования любой локализации, доброкачественные опухоли толстой кишки, аутоиммунные и инфекционные заболевания, хронические воспалительные заболевания толстой кишки (язвенный колит, болезнь Крона), осложненные формы дивертикулов, долихоколон, перитонит Malignant neoplasms of any localization, benign tumors of the colon, autoimmune and infectious diseases, chronic inflammatory diseases of the colon (ulcerative colitis, Crohn’s disease), complicated forms of diverticula, dolichocolon, peritonitis	–
Пол, n (%): Gender, n (%): женский female мужской male	66 (62,9) 39 (37,1)	47 (62,7) 28 (37,3)	χ² = 0,001; p = 0,979
Возраст, лет, Me (Q1; Q3) Age, years, Me (Q1; Q3)	64,0 (56,0; 69,5)	62,0 (50,0; 68,0)	U = 3448,0; p = 0,155
Гистологический тип опухоли, n (%): Histological type of the tumor, n (%): аденокарцинома adenocarcinoma	105 (100)	–	–
Стадия заболевания, n (%): Disease stage, n (%): III	105 (100)	–	–
Примечание. U – критерий Манна–Уитни; Me – медиана; Q1 – 1-й квартиль; Q3 – 3-й квартиль. Note. U – Mann–Whitney criterion; Me – median; Q1 – 1st quartile; Q3 – 3rd quartile.

 

Фрагменты опухоли у больных КРР и ткань толстой кишки у пациентов контрольной группы забирали во время хирургического вмешательства. Ткани помещали в стерильный физиологический раствор и транспортировали в иммунологическую лабораторию при температуре 4–10 °С в течение 30 мин.

Для получения клеточной суспензии применяли механическо-ферментный метод. Фрагменты ткани опухоли измельчали и гомогенизировали в гомогенизаторе GentleMACSDissociator (Miltenyi BiotecGmbH, Германия) с пробирками С-типа и с использованием набора реагентов TumorDissociationKit (Miltenyi BiotecGmbH, Германия) согласно инструкции производителя. Полученную суспензию клеток фильтровали через капроновый фильтр с ячейками размером 70 мкм (Miltenyi BiotecGmbH, Германия). Полученные клетки отмывали промывающим буфером autoMACS Rinsing Solution (Miltenyi BiotecGmbH, Германия). Все исследования проводили в течение 6 ч после забора материала.

Суспензию клеток в объеме 100 мкл окрашивали моноклональными антителами CD19-FITC (клон J3-119), CD25-PE (клон B1.49.9), CD45RA-ECD (клон ALB11), CD279-PC5.5 (клон PD1.3), CD127-PC7 (клон R34.34), CD278-Pacific Blue (клон C398.4A), CD45-Krome Orange (клон J33), CD197-Brilliant Violet 605™ (клон G043H7) (все Beckman Coulter, США), CD4-BUV395 (клон RPA-T4), CD8-BUV496 (клон RPA-T8), CD3-BUV661 (клон UCHT1) (все Becton Dickinson, Великобритания), CD278-Pacific Blue (клон C398.4A), CD197-Brilliant Violet 605™ (клон G043H7) (все BioLegend, Inc., США).

Жизнеспособность клеток оценивали с помощью красителя iFluor860 (AAT Bioquest, США). Оптимальные комбинации антител, конъюгированных с различными флуорохромами, использовали в соответствии с рекомендациями Y. D. Mahnke и M. Roederer [8]. Окрашивание проводили в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин, после чего эритроциты лизировали путем добавления 975 мкл раствора VersaLyse Lysing Solution (Beckman Coulter, США) и 25 мкл фиксирующего раствора IOTest 3 Fixative Solution (Beckman Coulter, США) и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин. Образцы промывали 1 раз фосфатно-солевым буфером (PBS) в течение 7 мин при 400g, ресуспендировали в 250 мкл PBS с 2 % нейтрального формалина (Sigma-Aldrich Co., США) и анализировали с помощью проточной цитометрии. В образцах собирали не менее 50 000 клеток CD3⁺ для оценки иммунных клеток. Анализ образцов проводили на проточном цитофлуориметре CytoFLEX LX (Beckman Coulter, США). Цитофлуориметрические данные оценивали с помощью программы CytExpert software v.2.0 и Kaluza™ v.2.1.1 (Beckman Coulter, США).

Стратегия гейтирования T-рег. При использовании моноклональных антител идентифицировали клетки иммунной системы: Т-лимфоциты определяли как CD19⁻CD3⁺, Т-хелперы (Th) – как CD19⁻CD3⁺CD4⁺, цитотоксические Т-лимфоциты (Tcyt) – как CD19⁻CD3⁺CD8⁺, T-рег – как CD19⁻CD3⁺CD4⁺CD25^highCD127⁻. На основе экспрессии CD45RA и CD197 определены подтипы Т-рег: наивные (CD45RА⁺CD197⁺), центральной памяти (CD45RА^–CD197⁺), эффекторной памяти (CD45RА^–CD197^–) и терминально-дифференцированные CD45RA-положительные эффекторные Т-лимфоциты (TEMRA, CD45RА⁺CD197^–) [9]. Экспрессия PD-1 и ICOS оценена в общем пуле T-рег. Cхема гейтирования, используемая для идентификации регуляторных Т-лимфоцитов и их субпопуляций, представлена на рис. 1.

 

Рис. 1. Схема гейтирования, используемая для идентификации основных популяций Т-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов, стадий их дифференцировки и экспрессии CD279 и CD278 регуляторных Т-клеток (Treg): а – исключение артефактов (включало временные ограничения); б – выделение живых клеток; в – выделение лейкоцитов (WBC); г – выделение лимфоцитов (LY); д – исключение дублетов из анализа LY с использованием прямого рассеивания света по высоте импульса рассеянного света (FSC-Н) и прямого рассеивания света по площади под кривой (FSC-А); е – выделение Т-лимфоцитов (CD19^–CD3⁺)

Fig. 1. Gating strategy used to identify major T cell populations, regulatory T cells, their differentiation stages and expression of CD279 and CD278 regulatory T cells (Treg): a – artifact exclusion included time restrictions; б – live cell isolation; в – white blood cell (WBC) isolation; г – lymphocyte (LY) isolation; д – doublet exclusion from LY analysis using (forward scatter height) (FSC-H) and forward scatter area (FSC-A); е – T cell isolation (CD19^–CD3⁺)

 

Рис. 1. Окончание. Схема гейтирования, используемая для идентификации основных популяций Т-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов, стадий их дифференцировки и экспрессии CD279 и CD278 регуляторных Т-клеток (Treg): ж – Т-хелперные клетки (Th) (определяли как CD3⁺CD4⁺-лимфоциты); з – Т-цитотоксические (Tсyt) клетки (определяли как CD3⁺CD8⁺-лимфоциты); и – регуляторные Т-клетки (Treg) (идентифицировали как субпопуляцию CD4⁺CD25^hi в пределах общих CD3⁺CD4⁺-клеток); к – основные стадии дифференцировки Treg (наивные клетки (naive) – CD45RA⁺CD197⁺, клетки центральной памяти (CM) – CD45RA^–CD197⁺, клетки эффекторной памяти (EM) – CD45RA^–CD197^–, терминально-дифференцированные клетки (TEMRA) – CD45RA⁺CD197^–; л – экспрессия рецептора программируемой клеточной гибели 1 (PD-1) (CD279) и индуцируемого костимулятора T-лимфоцитов (ICOS) (CD278) общим пулом T-рег. SSC – боковое рассеивание

Fig. 1. The end. Gating strategy used to identify major T cell populations, regulatory T cells, their differentiation stages and expression of CD279 and CD278 regulatory T cells (Treg): ж – T helper (Th) cells (were defined as CD3⁺CD4⁺ LY); з – T cytotoxic cells (Tсyt) (were defined as CD3⁺CD8⁺ LY); и – regulatory T cells (Treg) (were identified as a CD4⁺CD25^hi subset within the total CD3⁺CD4⁺ cells); к – the main stages of Treg differentiation (naive cells – CD45RA⁺CD197⁺, central memory cells (CM) – CD45RA^–CD197⁺, effector memory cells (EM) – CD45RA^–CD197^– and terminally differentiated cells (TEMRA) – CD45RA⁺CD197^–); л – expression of programmed cell death 1 (PD-1) (CD279) and inducible T-cell costimulator (ICOS) (CD278) by the total Treg pool. SSC – Side Scatter

 

С учетом численности исследуемых групп (n >50) оценку нормальности распределения признаков проводили с помощью критерия Колмогорова–Смирнова. Поскольку наблюдалось распределение признаков, отличное от нормального, интервальные данные представлены в виде медианы, 1-го и 3-го квартилей. Для сравнения 2 независимых групп по одному количественному признаку применяли непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при р <0,05. Статистический анализ выполняли с использованием IBM SPSS Statistics Version 25.0 (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты цитофлуориметрического анализа показали, что в ткани первичной опухоли больных колоректальным раком в 4,4 раза увеличивается количество Т-рег (табл. 2).

 

Таблица 2. Подтипы регуляторных Т-клеток (T-рег) в ткани опухоли у больных колоректальным раком

Table 2. Subtypes of regulatory T cells (Treg) in tumor tissue of patients with colorectal cancer

Субпопуляции T-рег, % Subpopulations Treg, %	Контроль (n =75) Control (n = 75)	Колоректальный рак (n = 105) Colorectal cancer (n = 105)	U-критерий Манна–Уитни Mann–Whitney U test	р
T-рег Treg	1,59 [0, 7; 2, 3]	7,0 [4, 7; 9, 9]	660	<0,001
T-рег наивные Treg naive	64,7 [50, 8; 72, 9]	47,4 [36, 9; 62, 2]	1974	<0,001
T-рег центральной памяти Treg central memory	29,6 [20, 7; 36, 3]	30,9 [20, 7; 38, 0]	3731	0,549
T-рег эффекторной памяти Treg effector memory	5,3 [2, 6; 8, 2]	14,7 [10, 6; 17, 5]	454,5	<0,001
T-рег TEMRA Treg TEMRA	1,7 [0, 6; 2, 5]	5,3 [3, 5; 8, 3]	364,5	<0,001
Примечание. TEMRA – терминально-дифференцированные лимфоциты; Me – медиана; Q1 – 1-й квартиль; Q3 – 3-й квартиль. Note. TEMRA – terminally differentiated lymphocytes; Me – median; Q1 – 1st quartile; Q3 – 3rd quartile.

 

Одновременно с этим происходит изменение субпопуляционного состава данных лимфоцитов. Так, в 1,4 раза уменьшается количество наивных Т-рег и возрастает относительное содержание дифференцированных клеток данного типа. Отмечено увеличение в 2,8 раза количества Т-рег эффекторной памяти (CD45RА^–CD197^–) и в 3,1 раза – терминально-дифференцированных клеток, экспрессирующих молекулу CD45RА. Статистически значимых различий в количестве инфильтрирующих первичную опухоль Т-рег центральной памяти, экспрессирующих CD197, между группами выявлено не было (см. табл. 2).

Данные, полученные в ходе цитометрического анализа, показали, что в опухолевой ткани первичного очага у больных раком толстой кишки в 2 раза увеличивается относительное содержание Т-рег, экспрессирующих на своей поверхности ICOS (табл. 3).

 

Таблица 3. Экспрессия костимулирующих и коингибирующих молекул на регуляторных Т-клетках в опухолевой ткани больных колоректальным раком

Table 3. Expression of co-stimulatory and co-inhibitory molecules on regulatory T cells in tumor tissue of patients with colorectal cancer

Субпопуляции T-рег, % Subpopulations Treg, %	Контроль (n =75) Control group (n = 75)	Колоректальный рак (n = 105) Colorectal cancer (n = 105)	U-критерий Манна–Уитни Mann-Whitney U test	p
T-рег-PD-1+ICOS− Treg PD-1+ICOS−	23,1 [13, 2; 30, 2]	18,3 [11, 1; 29, 3]	3453,5	0,16
T-рег-PD-1−ICOS+ Treg PD-1−ICOS+	4,8 [2, 7; 6, 8]	9,58 [7, 3; 13, 0]	876,5	<0,001
T-рег-PD-1+ICOS+ Treg PD-11+ICOS+	32,9 [25, 7; 42, 2]	39,2 [29, 3; 54, 6]	2512	<0,001
T-рег-PD-1−ICOS− Treg PD-1−ICOS−	38,3 [28, 9; 48, 8]	26,9 [19, 4; 34, 4]	1713	<0,001
Примечание. T-рег – регуляторные Т-клетки; PD-1 – рецептор программируемой клеточной гибели; ICOS – индуцируемый костимулятор T-лимфоцитов; Me – медиана; Q1 – 1-й квартиль; Q3 – 3-й квартиль. Note. Treg – regulatory T cells; PD-1 – programmed cell death protein; ICOS – inducible T-lymphocyte co-stimulator; Me – median; Q1 – 1st quartile; Q3 – 3rd quartile.

 

Статистически значимых различий в уровне экспрессии коингибирующего рецептора PD-1 на T-рег в первичном очаге опухолевого роста между группами не зарегистрировано. В то же время установлено увеличение на 20 % количества T-рег, которые одновременно экспрессировали как костимулирующую молекулу ICOS, так и коингибирующий рецептор PD-1. Количество клеток T-рег-PD-1⁻ICOS⁻ в первичном очаге опухолевого роста при колоректальном раке по отношению к контрольной группе было в 1,4 раза меньше (см. табл. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные нами данные показали, что при КРР в первичном очаге опухолевого роста увеличивается относительное содержание T-рег. Эти иммунные клетки подавляют функциональную активность эффекторных C8⁺- и СD4⁺-лимфоцитов [5]. Поэтому следует полагать, что T-рег играют ключевую роль в механизмах формирования опухолевой иммуносупрессии при КРР. Мы установили, что в опухолевом микроокружении при данной патологии снижается количество наивных T-рег, экспрессирующих на своей мембране CD197 (CCR7), который представляет собой хемокиновый хоуминг-рецептор, способствующий транслокации наивных клеток в лимфатические узлы. ССR7 является одной из ключевых молекул, способствующих инициации адаптивного иммунного ответа на онкоантиген. Более того, наивные Т-рег экспрессируют молекулу клеточной адгезии CD62L, которая также необходима для хоуминга Т-рег во вторичные лимфоидные органы и способствует взаимодействию наивных Т-рег и клеток эндотелия в лимфатических узлах [10]. Наивные T-рег отличаются повышенной секрецией IL-2. Одновременно с этим увеличивается относительное содержание T-рег эффекторной памяти (CD45RА^–CD197^–) и терминально-дифференцированных T-рег (CD45RА⁺CD197^–). Т-рег эффекторной памяти экспрессируют антиген CD45R0. Данные клетки секретируют иммуносупрессивный цитокин IL-10, экспрессируют на своей поверхности белки иммунного цикла CTLA-4 и ICOS, а также хемокиновые рецепторы, способствующие транслокациии Т-рег эффекторной памяти в очаг опухолевого роста. Т-рег эффекторной памяти тропны к нелимфоидным органам [11]. Терминально-дифференцированные клетки (TEMRA), имеющие фенотип CD45RА⁺CD197^–, являются заключительной стадией созревания Т-рег. Данные клетки реализуют свои эффекторные свойства в очаге опухолевого роста под влиянием IL, продуцируемых клетками врожденного иммунитета. Т-рег TEMRA блокируют эффекты CD8⁺-лимфоцитов, имеют короткий жизненный цикл, обладают низкой пролиферативной активностью и экспрессируют на своей поверхности адгезионные белки и хемокиновые рецепторы, способствующие миграции в нелимфоидные органы, в частности в очаги опухолевого роста [12].

Опухолевые клетки активно способствуют миграции Т-рег в свое микроокружение путем секреции хемокинов. При гемобластозах, а также некоторых солидных опухолях характерно увеличение количества Т-рег в крови, первичном очаге опухолевого роста и регионарных лимфатических узлах [12]. Установлена корреляционная связь между повышенным содержанием Т-рег и неблагоприятным течением злокачественного заболевания [13]. Согласно результатам анализа литературы, роль иммунных контрольных точек (ИКТ) в функционировании Т-рег довольно противоречива. Так, доказано, что Т-рег экспрессируют ряд коингибирующих молекул (PD-1, TIM-3, LAG-3). Более того, повышенная экспрессия коингибирующих ИКТ коррелирует с повышенной супрессорной активностью данных клеток [14]. Однако в работе R. Karim и соавт. показано, что PD-1 снижает функциональную активность Т-рег [15]. Результаты исследования в культуре регуляторных Т-клеток продемонстрировали, что моноклональные антитела к PD-1 вызывают увеличение активности Т-рег [16]. Y. Dong и соавт. выявили, что PD-1 вызывает трансформацию эффекторных Т-клеток в индуцированные Т-рег [17]. В литературе имеются неоднозначные данные в отношении иммунотерапии, основанной на использовании моноклональных антител к PD-1 и функциональной активности Т-рег. Так, на мышиной модели остеосаркомы показано, что при использовании анти-PD-1-терапии наблюдается снижение количества и функциональной активности Т-рег в опухоли [18]. По результатам протеомного анализа обнаружена активация супрессорных генов в инфильтрирующих опухоль Т-рег после анти-PD-1-терапии у пациентов с немелкоклеточным раком легкого и мезотелиомой [19]. В связи с противоречивостью данных необходимы дальнейшие исследования роли ИКТ в модуляции функциональной активности Т-рег.

Индуцируемый Т-клеточный костимулятор (ICOS) представляет собой белок суперсемейства CD28 с молекулярной массой 55~60 кДа, который первоначально был обнаружен на поверхности Т-клеток при стимуляции Т-клеточного рецептора. ICOS экспрессируется на Т-хелперах 1-, 2- и 17-го типов, Т-фолликулярных хелперных клетках и Т-рег [20]. Т-рег, экспрессирующие эту костимулирующую молекулу, обладают повышенной ингибирующей активностью в отношении эффекторных Т-клеток. Показано, что высокая экспрессия ICOS на Т-рег наблюдается при плоскоклеточном раке головы и шеи [21], раке яичников [22] и остром миелоидном лейкозе [23]. Имеются данные о том, что повышенная экспрессия ICOS на Т-рег коррелирует с прогрессией злокачественного новообразования и неблагоприятным прогнозом при раке желудка [24]. Экспрессия лиганда ICOS (ICOSL) на опухолевых клетках при раке желудка или на дендритных клетках приводит к увеличению инфильтрирующих опухоль ICOS⁺-Т-рег [25]. Можно предположить, что взаимодействие ICOS и ICOSL является значимым механизмом ускользания злокачественных клеток от иммунного ответа. Между тем имеются сообщения о том, что высокая экспрессия ICOS на инфильтрирующих опухоль цитотоксических Т-лимфоцитах и Т-хелперах, отличных от Т-рег, коррелирует с улучшением показателей выживаемости, например, при аденокарциноме легкого [26].

Мы получили интересные данные о том, что на поверхности Т-рег, инфильтрирующих опухоль при КРР, не повышается экспрессия коингибирующей молекулы PD-1. Вместе с тем зарегистрировано увеличение количества Т-рег, совместно экспрессирующих ICOS и PD-1. ICOS как костимулирующая молекула не обладает прямой ингибирующей функцией. Вероятно, передача сигналов ICOS может влиять на экспрессию других коингибирующих молекул, в частности PD-1. Данный феномен требует дальнейшего изучения.

Результаты нашего исследования свидетельствуют об участии T-рег, коингибирующего рецептора PD-1 и костимулирующей молекулы ICOS в формировании иммуносупрессивной среды в первичном очаге опухолевого роста при КРР. Однако наша работа имеет некоторые ограничения. В частности, не изучены изменения субпопуляционного состава Т-рег и уровня экспрессии ИКТ в регионарных лимфатических узлах, не установлены корреляционные связи изменений Т-рег с прогрессированием КРР, не представлены данные об изменении количественного состава и функциональной активности Т-рег у больных, получавших иммунотерапию. Это свидетельствует о необходимости проведения дальнейших исследований. Определение подтипов Т-рег может иметь диагностическое и прогностическое значение при КРР. Результаты исследований показали, что T-рег следует рассматривать как перспективные клетки-мишени в стратегии иммунотерапии больных раком толстой кишки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У больных раком толстой кишки в первичном очаге опухолевого роста увеличивается относительное содержание Т-рег. Одновременно с этим уменьшается количество наивных Т-рег и увеличивается относительное содержание дифференцированных лимфоцитов данного типа. В опухолевом микроокружении при КРР растет количество Т-рег, экспрессирующих индуцируемый костимулятор T-лимфоцитов ICOS, а также одновременно экспрессирующих как костимулирующую молекулу ICOS, так и коингибирующий рецептор PD-1.

About the authors

V. V. Kryukova

Chita State Medical Academy, Ministry of Health of Russia

Email: viktorcepelev@mail.ru
ORCID iD: 0009-0008-2228-3351
SPIN-code: 7136-0110
Russian Federation, 39a Gorkogo St., Chita 672000

V. L. Tsepelev

Chita State Medical Academy, Ministry of Health of Russia

Author for correspondence.
Email: viktorcepelev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2166-5154
SPIN-code: 4624-4537
Russian Federation, 39a Gorkogo St., Chita 672000

P. P. Tereshkov

Chita State Medical Academy, Ministry of Health of Russia

Email: viktorcepelev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8601-3499
SPIN-code: 5228-8808
Russian Federation, 39a Gorkogo St., Chita 672000

References

Supplementary files