Development and clinical approbation of miR-THYROID test-system for differential diagnosis of thyroid follicular adenomas and carcinomas

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Узловые образования щитовидной железы (ЩЖ) являются относительно часто встречающейся патологией. Их диагностируют примерно у 50 % женщин старше 70 лет [1, 2]. В большинстве случаев узлы ЩЖ являются доброкачественными; в случаях, если они оказываются злокачественными, необходимо хирургическое лечение.

Отечественные и зарубежные диагностические алгоритмы [3, 4], по сути, определяют порядок исследований, направленных в первую очередь на выявление злокачественных узлов. Диагностика включает врачебный осмотр, ультразвуковое исследование ЩЖ и регионарных лимфатических узлов и цитологическое исследование материала, полученного с помощью тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ) с последующей градацией на 6 диагностических групп в соответствии с системой Bethesda (2023). Использование стандартного алгоритма позволяет выявить злокачественные узлы ЩЖ в 70–85 % случаев. В 15–30 % случаев степень риска злокачественной природы узлового образования составляет в среднем от 22 % (III категория по системе Bethesda – атипия неясного значения) до 30 % (IV категория по системе Bethesda – фолликулярная неоплазия). Этот диапазон составляет так называемую серую зону неоплазий ЩЖ. При отсутствии методов более точной диагностики хирургическая лечебная тактика является вынужденным методом выбора для пациентов с цитологическим заключением III/IV по системе Bethesda.

Потенциальным методом уточняющей диагностики для этой когорты пациентов является молекулярно-генетическое исследование материала ТАБ. Первыми были предложены методы анализа характерных мутаций ДНК, например 7-gene panel test (7-генная панель), предполагающий анализ экспрессии генов BRAF, RAS (H/N/K), PAX8/PPARG, RET/PTC1 и RET/PTC3. В нескольких независимых исследованиях этот тест продемонстрировал высокое отрицательное прогностическое значение (ОПЗ) (81,8–82 [5], 91 [6] и 94 % [7]). Однако невысокое положительное прогностическое значение (ППЗ) этого теста оставило открытым вопрос о необходимости проведения операций.

При анализе единичных мутаций тесты на основе технологии глубокого секвенирования (deep sequencing) обладают заведомо более высоким диагностическим потенциалом, чем полимеразная цепная реакция (ПЦР). Например, ППЗ и ОПЗ теста ThyroSeq v3, предполагающего качественный анализ 112 генетических мутаций, составляют 78,2 и 75,9 % соответственно [8], теста Afirma GSC, с помощью которого проводят количественный анализ 167 молекул матричной РНК (мРНК), – 100 и лишь 58 % соответственно [9]. Вместе с тем при очевидной диагностической эффективности высокая стоимость этих исследований является существенным препятствием к их широкому использованию. Можно полагать, что сужение панели тестируемых генов будет решением проблемы (примеры: Thyro Track – определение 57 мутаций [10], FSZ-Thyroid NGS Panel – определение 14 мутаций [11]).

Принципиального снижения стоимости исследования можно добиться при использовании ПЦР. Например, ППЗ и ОПЗ теста ThyroidPrint, предполагающего количественный анализ мРНК 10 генов (TIMP1, CLDN1, KTR19, AFAPL2, HMOX1, CXCR3, CXCL10, CCR3, CCR7, CXADR), составили 78 и 95 % соответственно [12, 13], теста mir-THYpe, обеспечивающего количественный анализ 10 микроРНК (let-7a, miR-103, miR-125a-5p, let-7b, miR-145, -146b, -152, -155, -200b и -181b), – 66,2 и 95 % соответственно [14, 15]. Эти примеры показывают, что a priori диагностические потенциалы экономичных тестов на основе ПЦР и тестов на основе глубокого секвенирования сопоставимы. Очевидные перспективы имеют также методы, сочетающие различные технологии для анализа молекулярных маркеров разных классов. Например, анализ 8 генетических аномалий (7-генная панель + TERT), дополненный оценкой экспрессии 10 молекул микроРНК (ThyGenX-ThyraMIR), предложен исследователями из Медицинского центра Дартмута Хичкока (США) [16]. Комплексная оценка ряда параметров, включая мутации (BRAFV^600E), соотношение митохондриальной и ядерной ДНК, количественный анализ мРНК (GCM2, HMFA2) и микроРНК (miR-146b, -221, -375, -31, -551b -29b, -23a и -197), рассматривается в качестве метода дифференциальной диагностики узловых образований ЩЖ исследователями из Института молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук [17].

Глубокий сравнительный анализ наиболее перспективных методов молекулярно-генетических исследований материала ТАБ представлен R. Chowdhury и соавт. [18]. Выводы авторов указывают на нерешенные проблемы интерпретации и клинического применения разработанных тест-систем, с чем трудно не согласиться. Связь между маркерами, используемыми в ходе молекулярно-генетических исследований, и клинико-морфологическими особенностями узлов ЩЖ в ряде случаев известна и понятна. Поэтому существующие тесты зачастую основаны на эмпирических комбинациях молекулярных маркеров и не всегда могут однозначно решить клинические вопросы. Например, наиболее «продвинутые» продукты – ThyroSeq v3 и Afirma GSC – оказались малоинформативными при Гюртле-клеточных неоплазиях ЩЖ [19]. Классификатор ThyraMIR не позволяет дифференцировать доброкачественные и злокачественные образования ЩЖ, в которых обнаружена мутация в гене RAS [20].

В ряде ранее проведенных исследований мы показали возможность решения относительно узкой задачи – дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных узлов ЩЖ из фолликулярного эпителия путем анализа пар микроРНК с реципрокным характером ассоциированных с фолликулярным раком (ФР) экспрессионных изменений [21, 22]. Итогом этих исследований стало создание тест-системы «миР-ТИРОИД», процесс разработки и результаты клинической апробации которой представлены в данной статье.

Цель исследования – разработка и апробация набора реагентов («миР-ТИРОИД») для дифференциальной диагностики фолликулярной аденомы (ФА) и ФР ЩЖ с помощью реакции обратной транскрипции и последующей ПЦР (ОТ-ПЦР) молекул микроРНК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Биологический материал. Перед включением в исследование биологические образцы и клинические данные были деперсонализированы. В работе использованы данные анализа, проведенного ранее с применением фиксированных в 10 % забуференном формалине и залитых в парафин 12 образцов ФА и 12 образцов высокодифференцированного ФР ЩЖ [21], а также цитологические препараты (материал ТАБ) ФА (n = 20) и ФР (n = 20). Во всех случаях пациенты, имеющие одиночные (солитарные) узлы ЩЖ, перенесли хирургическое лечение в течение 1–2 мес после ТАБ.

Результаты гистологических исследований операционного материала позволили сформировать группы образцов цитологического материала. В исследование не включались случаи несоответствия морфологических диагнозов (цитологического и послеоперационного гистологического) и случаи недостаточной клеточности материала ТАБ.

Выделение РНК. Цитологические препараты обрабатывали 600 мкл лизис-буфера (4 М гуанидинизотиоцианата, 25 мМ цитрата натрия, 0,3 % саркозила натрия, 3 % дитиотреитола), лизат переносили в пробирки. Далее для выделения РНК использовали набор ALPREP max (ООО «Альгимед-Техно», Республика Беларусь), основанный на обратимом связывании нуклеиновых кислот с поверхностью магнитных частиц, в соответствии с протоколом производителя. На финальном этапе проводили элюцию РНК в 100 мкл буфера (50 мМ Tris-HCl, pH 6–7). Концентрацию и качество выделенной РНК оценивали с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000C (Thermo Scientific, США).

ОТ-ПЦР. В исследовании использовали синтетические олигонуклеотиды (ОТ-, ПЦР-праймеры, зонды и синтетические аналоги микроРНК) производства компании «Синтол» (Россия), ревертазу ALZYME RT (ООО «Альгимед-Техно», Республика Бедарусь) и набор «БиоМастер» HS-Taq ПЦР (2×) («Биолабмикс», Россия). Анализ каждой микроРНК предполагал проведение двухфланговой (two-tailed) микроРНК-специфичной реакции ОТ с последующей ПЦР. Объем реакционных смесей ОТ и ПЦР составлял по 10 мкл; состав реакционных смесей и условия реакций соответствовали рекомендациям производителей ферментов и были детально описаны ранее [23, 24]. Интенсивность амплификации оценивали с помощью флуоресцентно-меченного ПЦР-зонда по каналу FAM. ОТ-ПЦР для каждого образца выполняли в 2 технических повторах, результаты усредняли. Все реакции ОТ-ПЦР проводили в амплификаторе CFX96 Touch™ (Bio-Rad, США).

Статистический анализ данных. Файл, содержащий прочитанные последовательности, сгенерирован с помощью программного обеспечения DNBSEQ-G400RS Software. Первичную оценку показателей качества секвенирования выполнили с использованием программы FastQC [25]. Следующие этапы анализа проведены с помощью BioPython – модуля языка программирования Python, содержащего дополнительные средства и функции для биоинформатического анализа [26]. Предварительный анализ данных включал фильтрацию по показателю качества идентификации азотистых оснований для исключения последовательностей с точностью прочтения ниже 99,9 %. Идентификация зрелых молекул микроРНК (mapping) проведена с помощью базы даных miRbase [27]; критерием идентификации служило полное совпадение последовательности. В целях сопоставления результатов анализа образцов для каждого из них число индивидуальных молекул было нормализовано относительно общего числа идентифицированных микроРНК (Reads Per Million, RPM).

В ходе дизайна систем ОТ-ПЦР-анализа использовали открытые ресурсы RNAstructure Software v6.5 [28] и PerlPrimer v1.1.21 [29]. Для предварительной оценки данных ОТ-ПЦР результаты нормализовывали относительно среднего значения порогового цикла (Ct) всех микроРНК (n = 22), полученных при анализе каждого образца по стандартной формуле: dCt = 2^{Ct(miRNA)-Ct(average)}. После выбора потенциально маркерных молекул использовали метод реципрокных пар, детально описанный ранее [23, 24].

Оценку статистической значимости разницы уровней экспрессии отдельных микроРНК в сравниваемых группах проводили с помощью непараметрического U-критерия Манна–Уитни. Диагностическую значимость определяли с использованием ROC-анализа, расчета показателей чувствительности, специфичности, ППЗ и ОПЗ.

Расчеты и иллюстрации выполнены с помощью программ DNBSEQ-G400RS Software, CFX Manager Software, Excel 10.0 и Sigma Plot 11,0 GraphPad Prizm 10.5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Выбор потенциально маркерных молекул. Выбор потенциально маркерных молекул микроРНК на основе анализа данных глубокого секвенирования проводили с учетом 3 параметров. Во-первых, молекулы (потенциально маркерные или потенциальные нормализаторы) должны быть достаточно многокопийными для их последующего анализа с помощью ПЦР. Во-вторых, необходимо, чтобы экспрессия потенциально маркерных молекул в образцах ФА и ФР была разной. Соотношение этих параметров (log₂ (fold change) vs log₂ (expression)) на массиве данных экспрессии всех молекул микроРНК, идентифицированных в 24 образцах (12 ФА и 12 ФР), представлено на рис. 1, а. В-третьих, различия в уровне экспрессии потенциально маркерных молекул (ФА vs ФР) должны быть статистически значимы. Соотношение параметров дифференциальной экспрессии (log₂ (fold change)) и статистической значимости этих различий (–log₂ (p-value))на том же массиве данных представлено на рис. 1, б.

 

Рис. 1. Экспрессия микроРНК в клетках фолликулярной аденомы (ФА) (n = 12) и фолликулярного рака (ФР) (n = 12): а – соотношение уровней общей и дифференциальной экспрессий. По оси абсцисс дано среднее для всех 24 образцов нормализованное значение экспрессии (expression – RPM, read per million), по оси ординат – соотношение количества молекул в образцах ФР относительно образцов ФА (fold change); б – соотношение уровней дифференциальной экспрессии и статистической значимости. По оси абсцисс дано соотношение количества молекул в образцах ФР относительно образцов ФА (fold change), по оси ординат – T-критерий Уилкоксона (p-value), характеризующий статистическую значимость различий в уровнях экспрессии. Результаты анализа данных глубокого секвенирования представлены в виде volcano-диаграмм, где каждая точка отражает характер экспрессии 1 молекулы в 2 группах образцов – ФА и ФР. Для наглядности результаты представлены как log₂. Цветом выделены молекулы, выбранные для следующих этапов анализа: потенциальные маркеры ФР, маркеры ФА и молекулы, которые могут быть использованы в качестве нормализаторов данной молекулы в 2 сравниваемых группах образцов (ФА и ФР)

Fig. 1. Expression of microRNAs in follicular adenoma (FA) (n = 12) and follicular cancer (FC) (n = 12) cells: а – ratio between total and differentail exprеsssion. On the x-axis, mean normalized expression (expression – RPM, reads per million) in all 24 samples is plotted, on the y-axis – ratio between the number of molecules in FC samples relative to FA samples (fold change); б – relationship between differential expression and statistical significance. On the x-axis, ratio between the number of moleculues in FC samples and in FA samples (fold change) is plotted; on the y-aixs – Wilcoxon T-criterion (p value) characterizing statistical significance of expression level differences. Results of analysis of deep sequencing data are presented as volcano plots where each point represents expression of 1 molecule in 2 sample groups: FA and FC. For clarity, the resuts are presented as log₂. Molecules selected for subsequent stages of analysis are colored: potential FC markers, FA markers, and molecules that can be used for normalization of this molecule in 2 comparison groups (FA and FC)

 

При выборе маркерных микроРНК учтены данные научной литературы для исключения молекул, не упомянутых ранее в контексте исследований злокачественных опухолей ЩЖ. На этом этапе выбраны 53 молекулы, включая потенциальные маркеры ФР, ФА и потенциальные нормализаторы.

Дизайн и тестирование аналитических систем. Для выбранных молекул проведен дизайн аналитических систем, включающих двухфланговый ОТ-праймер, прямой и обратный праймеры для ПЦР и зонд с учетом рекомендаций разработчиков технологии two-tailed RT-PCR [30] и собственного опыта [31]. Для эффективной и специфичной инициации ОТ ОТ-праймер должен формировать стабильную шпильку с 2 свободными флангами (рис. 2, а), комплементарными участкам микроРНК. Структуру ОТ-праймера моделировали с помощью программы RNAstructure Software. В ряде случаев последовательности флангов препятствовали формированию правильной структуры при использовании определенной последовательности шпильки (рис. 2, б). Так, в ходе данной работы не удалось выбрать удачную последовательность ОТ-праймера для 3 молекул (miR-22-3p, -130a-3p и -139-5p), которые пришлось исключить из исследования.

 

Рис. 2. Модели структуры праймера для обратной транскрипции, рассчитанные с помощью программного обеспечения RNAstructure v.6.5 для молекулы hsa-miR-192-5p: а – оптимальный вариант праймера с правильной структурой; б – праймер с нестабильной пространственной структурой

Fig. 2. Primer structure models for reverse transcription, calculated using the software RNAstructure v.6.5 for the hsa-miR-192-5p molecule: a – optimal primer variant with the correct structure; б – primer with an unstable spatial structure

 

После синтеза олигонуклеотидов эффективность каждой аналитической системы оценена путем проведения серии ОТ-ПЦР; в качестве анализируемых образцов использовали растворы синтетических аналогов микроРНК в концентрации от 10² до 10¹³ молекул в реакции ОТ. На рис. 3, а представлены результаты такого исследования: кривые амплификации (сверху) и соответствующий график зависимости значений Ct от концентрации аналита (снизу). Каждая система имела определенный лимит детекции – нижний предел измеряемой концентрации микроРНК. При дальнейшем снижении концентрации микроРНК значение Ct не увеличивалось, формируя так называемое плато. Важной характеристикой системы являлся диапазон линейной зависимости между концентрацией микроРНК и значением Ct, который в идеале может составлять 9–11 порядков (от 10³ до 10¹² молекул в реакции ОТ). С учетом 2 параметров (предела чувствительности и диапазона аналитической эффективности) выбраны системы для дальнейших исследований. Десять неудачных систем (см. рис. 3, б) были исключены из дальнейшей работы, в том числе let-7a-5p, miR-17-5p, -21-5p, -29c-3p, -30a-5p, -146a-5p, -155-5p, -200b-3p, -200с-3p и -1246.

 

Рис. 3. Результаты оценки аналитических характеристик систем для анализа 2 молекул hsa-miR-15a-5p (а) и hsa-miR-1246-5p (б) с помощью реакции обратной транскрипции и последующей полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). В качестве аналита использованы серии разведений синтетических аналогов микроРНК (от 10 до 10¹³ молекул в реакции ОТ). Все реакции проведены в двух повторах, результаты усреднены. Сверху приведены кривые амплификации, снизу – те же данные представлены в виде графиков зависимости значений пороговых циклов (Ct) ПЦР от концентрации аналитов

Fig. 3. Results of the evaluation of the analytical characteristics of systems for analysis of 2 molecules hsa-miR-15a-5p (a) and hsa-miR-1246-5p (б) by reverse transcription with following polymerase chain reaction (RT-PCR). Serial dilutions of synthetic microRNA analogs (10 to 10¹³ molecules in the reverse transcription (RT reaction mixture)) were used as the analyte; all reactions were performed in duplicate, and the results were averaged. Top – amplification curves. bottom – the same data are presented as graphs of the dependence of the threshold cycle (Ct) values of PCR on the concentration of analytes

 

Еще одним критерием пригодности разработанных аналитических систем была эффективность анализа маркерных микроРНК в исследуемом биологическом материале. Этот параметр трудно предсказать или смоделировать, поскольку он определяется рядом факторов: концентрацией маркерной молекулы в тироцитах, наличием близких по структуре микроРНК, эффективностью выделения и стабильностью именно этих молекул, особенностями аналитической системы. Для оценки пригодности систем использована архивная коллекция 7 образцов ткани ЩЖ (блоки, фиксированные в формалине и залитые в парафин), из которых выделена РНК, и проведен анализ всех исследуемых микроРНК. Критерием оценки было число циклов (>7,5) между значением плато (результат ОТ-ПЦР воды) и средним значением Ct при анализе образцов, так называемый запас чувствительности. Примеры систем с достаточным (хорошие) и недостаточным (плохие) запасами аналитической чувствительности представлены на рис. 4.

 

Рис. 4. Репрезентативные примеры систем с разным запасом аналитической чувствительности при анализе микроРНК в образцах ткани щитовидной железы (ЩЖ) с помощью обратной транскрипции (ОТ) и последующей полимеразной цепной реакции. Результаты анализа воды (без аналита в ОТ) соответствуют уровню плато (черные точки). Образцы РНК, выделенные из 7 образцов ткани ЩЖ (блоки, фиксированные в формалине и залитые в парафин), были использованы для анализа маркерных молекул. Результаты (значения порогового цикла (Ct)) представлены в виде зеленых (достаточный запас аналитической чувствительности) и серых (недостаточный запас аналитической чувствительности) точек

Fig. 4. Representative examples of systems with different level of analytical sensitivity in reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction analysis of microRNA in thyroid tissue samples. The result of water analysis (without analyte in RT) corresponds to the plateau level – black dots. Samples RNA extracted from seven thyroid tissue samples (formalin-fixed paraffin-embedded blocks) were used to analyze marker molecules. The results (threshold cycle (Ct) values) are presented as green (sufficient level of analytical sensitivity) and gray (insufficient level of analytical sensitivity) dots

 

По итогам оценки аналитических характеристик выбраны 22 системы для анализа потенциально маркерных молекул. Аналитические характеристики ОТ-ПЦР-систем анализа микроРНК представлены в табл. 1. Большая часть потенциально маркерных молекул (31 из 53) последовательно исключены из исследования, так как не удалось разработать дизайн ОТ-праймера (n = 3), получить системы с удовлетворительными аналитическими характеристиками (n = 10), или чувствительность разработанных систем оказалась недостаточной для анализа молекул в составе ткани ЩЖ (n = 18).

 

Таблица 1. Характеристики выбранных систем анализа микроРНК с помощью реакции обратной транскрипции и последующей полимеразной цепной реакции

Table 1. Characteristics of the selected systems of microRNA analysis using reverse transcription with subsequent polymerase chain reaction

МикроРНК MicroRNA	Показатель Parameter				Результаты анализа образцов ФР (n = 20) и ФА (n = 20) щитовидной железы Results of thyroid FC (n = 20) and FA (n = 20) sample analysis
	Ct плато Plateau Ct	Среднее пороговое значение Ct образцов (n =7) Mean threshold sample Ct (n =7)	Стандартное отклонение Standard deviation	Запас аналитической чувствительности (Ct плато – Ct образцов) Margin of analytical sensitivity (plateau Ct – sample Ct)	Кратность разницы экспрессии каждой молекулы в образцах ФР и ФА (fold change) ФА (fold change) Fold change of expression of each molecule in FC and FA samples	p	AUC
miR-7-5p	34,29	23,74	0,95	10,55	1,64	0,12	0,65
miR-15a-5p	32,9	23,16	1,30	9,75	7,29	0,00	0,87
miR-16-5p	31,55	18,81	0,64	12,74	1,40	0,75	0,53
miR-20a-5p	33,98	23,39	0,90	10,58	2,70	0,02	0,73
miR-23a-3p	31,03	22,26	0,38	8,77	1,03	0,62	0,45
miR-24-3p	29,43	19,67	0,62	9,76	0,45	0,00	0,18
miR-26b-5p	32,46	19,06	0,67	13,4	0,51	0,04	0,30
miR-27a-3p	30,08	20,88	0,38	9,19	1,31	0,89	0,51
miR-34a-5p	37,3	24,85	0,88	12,46	0,77	0,51	0,44
miR-93-5p	32,18	23,62	0,57	8,56	2,64	0,21	0,62
miR-106b-5p	38,12	26,87	0,52	11,26	5,88	0,02	0,73
miR-125b-5p	34,96	17,72	0,48	17,24	0,30	0,01	0,26
miR-126-3p	38,59	20,03	0,73	18,56	1,36	0,68	0,54
miR-141-3p	31,77	23,36	0,35	8,41	1,10	0,51	0,56
miR-143-3p	32,41	20,79	0,27	11,61	0,61	0,02	0,27
miR-146b-5p	35,04	27,31	0,65	7,73	0,44	0,00	0,11
miR-135b-5p	30,35	19,73	0,64	10,62	1,02	0,46	0,57
miR-182-5p	37,99	28,13	0,98	9,86	2,65	0,04	0,70
miR-185-5p	31,03	23,03	0,73	8	0,70	0,62	0,55
miR-191-5p	30,49	21,09	0,38	9,39	0,99	0,40	0,42
miR-192-5p	33,62	23,73	0,36	9,88	2,39	0,01	0,77
miR-221-3p	34,72	27,23	0,37	7,49	1,20	0,37	0,41
Примечание. Жирным шрифтом выделены результаты анализа образцов фолликулярного рака (ФР) и фолликулярной аденомы (ФА), на основе которых соответствующие молекулы были выбраны и включены в следующие этапы исследования. Ct – пороговый цикл; AUC – площадь под ROC-кривой. Note. Results of analysis of follicular cancer (FC) and follicular adenoma (FA) samples which served as the basis for selection of molecules for subsequent stages of the study are shown in bold. Ct – cycle threshold; AUC – area under ROC curve.

 

Анализ экспрессии микроРНК в цитологических образцах. Оценка экспрессии 22 потенциально маркерных микроРНК проведена с помощью разработанных систем. Для снижения эффекта качества анализируемого материала определено среднее арифметическое значение Сt (Ct_av) 22 молекул для каждого образца, результаты (Сt_miR) нормализованы относительно этого значения. Затем выполнено сравнение нормализованных значений Ct 2 групп – ФА (n = 20) и ФР (n = 20), вычислены показатели кратности наблюдаемых изменений (fold change), определены статистическая значимость различий (p-value) и диагностический потенциал каждой молекулы (см. табл. 1). Результаты анализа образцов ФА и ФР представлены в табл. 1.

Для молекул с повышенной экспрессией в образцах ФР (fold change >1) значение площади под кривой (aria under curve, AUC), полученное с помощью ROC-анализа, составило 0,5; молекул с относительно высоким уровнем экспрессии в образцах ФА (fold change <1) – <0,5. В случае, если разнонаправленные изменения экспрессионной активности молекул в образцах ФА и ФР ассоциированы друг с другом, соотношение экспрессионных изменений (или концентраций) таких молекул может иметь высокий диагностический потенциал. Молекулы формируют так называемые реципрокные пары. С учетом статистической значимости полученных результатов список потенциально маркерных молекул был сокращен до 10 (см. табл. 1, рис. 5).

 

Рис. 5. Результаты анализа экспрессии потенциально маркерных молекул микроРНК в образцах фолликулярной аденомы (ФА) и фолликулярного рака (ФР) щитовидной железы с помощью реакции обратной транскрипции и последующей полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Значения пороговых циклов (Ct) ПЦР нормализованы относительно среднего арифметического значения Ct 22 анализируемых молекул в рамках каждого образца. Статистическая значимость различий между уровнями экспрессии микроРНК в группах образцов оценена с помощью непараметрического U-критерия Манна–Уитни

Fig. 5. Results of the analysis of the expression of potentially marker microRNA molecules in follicular adenoma (FA) and follicular carcinoma (FC) samples of the thyroid by reverse transcription with following polymerase chain reaction (RT-PCR). The PCR threshold cycle (Ct) values are normalized relative to the arithmetic mean of the Ct values of 22 analyzed molecules within each sample. The statistical significance of the differences between microRNA expression levels in the sample groups was assessed using the non-parametric Mann–Whitney U-test

 

Разработка аналитического алгоритма. Результатом многоэтапного исследования стала разработка панели из 10 молекул микроРНК (см. рис. 5). Наблюдались статистически значимые различия в уровнях экспрессии каждой из этих молекул между группами образцов ФА и ФР. Но ни одна микроРНК не позволяла четко дифференцировать эти нозологии, т. е. не могла служить в качестве самостоятельного диагностического маркера, что отмечалось и ранее в многочисленных исследованиях. Создание алгоритма эффективной компиляции и клинически понятной интерпретации результатов количественного анализа нескольких маркерных молекул является «узким местом» в процессе разработки диагностических тест-систем. Выбор оптимального метода представляет собой весьма творческий процесс, и разработчики используют разные подходы к решению этой задачи. Например, понимание связи между отдельными маркерами и биологическими характеристиками ткани узла ЩЖ позволило авторам метода ThyroidINFO сформировать «дерево решений» [17]. Если биологическая роль отдельных маркерных молекул неизвестна, их эффективные комбинации могут быть выбраны эмпирически [32], с помощью алгоритмов ранжирования признаков [15] или методов машинного обучения и формирования прогностических моделей [33]. Последний вариант был нами успешно использован ранее, но для его реализации необходим относительно большой массив данных (количество образцов) для обучающей и тестовой выборок. В рамках данного исследования алгоритм вычисления критерия дифференциальной диагностики ФА и ФР разработан на основе результатов анализа 10 маркерных молекул в материале только 40 образцов.

Во-первых, из 10 выбранных маркерных микроРНК сформированы все возможные пары, рассчитаны соотношения (ratio) значений Ct в каждой паре по стандартной формуле: dCt = 2^{Ct(miR-1)-Ct(miR-2)} и проведена оценка диагностической значимости этих соотношений с помощью ROC-анализа. Семь из 10 молекул формировали 9 реципрокных пар с AUC >0,83. На рис. 6 представлены ROC-кривые и соответствующие значения AUC, для сравнения эти же значения подсчитаны с использованием данных секвенирования гистологических образцов.

 

Рис. 6. Результаты ROC-анализа значений соотношений порогового цикла (Ct) для 9 реципрокных пар микроРНК. В таблице представлено сопоставление значений площади под кривой (AUC), полученных при ROC-анализе данных реакции обратной транскрипции и последующей полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) и глубокого секвенирования

Fig. 6. Results of ROC analysis of ratios of Ct values for 9 reciprocal pairs of microRNAs. The table shows a comparison of the area under the curve (AUC) values obtained from ROC analysis of reverse transcription with following polymerase chain reaction (RT-PCR) and deep sequencing data

 

Во-вторых, в группе анализируемых образцов (ФА (n = 20) + ФР (n = 20)) для значения ratio каждой реципрокной пары молекул микроРНК определен диапазон колебания: минимальное значение принято за 0 %, максимальное – за 100 %. Затем результаты анализа каждой пары микроРНК по всем образцам выражены в % от диапазона наблюдаемых колебаний в группе (n = 40). Такая нормализация обеспечила возможность последующей компиляции 9 значений ratio, полученных для каждого образца. Компиляция проведена путем вычисления среднего арифметического значения ratio – ratio_average. Этот расчетный параметр получил название «миР-Т».

Использование параметра «мир-Т» в качестве диагностического критерия позволило дифференцировать ФА и ФР с чувствительностью 89,5 %, специфичностью 90 %, ППЗ 89,5 %, ОПЗ 90 % и точностью 89,7 %. Диагностическая характеристика параметра «мир-Т» при дифференциальной диагностике ФА и ФР представлена на рис. 7.

 

Рис. 7. Диагностическая характеристика параметра «миР-Т» при дифференциальной диагностике фолликулярной аденомы (ФА) и фолликулярного рака (ФР) щитовидной железы: а – распределение значений параметра «мир-Т» в группах ФА и ФР. Статистическая значимость различий в значениях парметра «мир-Т» между группами ФА и ФР оценена с помощью непараметрического U-критерия Манна–Уитни; б – ROC-кривая и значение площади под кривой (AUC) для параметра «миР-Т» в группах ФА и ФР

Fig. 7. Diagnostic characteristics of the “miR-T” parameter in the differential diagnosis of follicular adenoma (FA) and follicular carcinoma (FC) samples of the thyroid: a – distribution diagram of the “miR-T” parameter in the FA and FC groups.“miR-T” parameter values in groups FA vs FC was assessed using the non-parametric U-Mann–Whitney test; б – ROC curve and area under the curve (AUC) value for the “miR-T” parameter in the FA and FC groups

 

Разработанный диагностический критерий допустил ошибки в 4 из 40 случаев (результаты представлены на рис. 7, а). Это указывает на необходимость его дальнейшей оптимизации, для которой необходимо большее число цитологических образцов с верифицированным диагнозом.

ОБСУЖДЕНИЕ

Этапы разработки. В статье представлен многоэтапный процесс создания тест-системы «миР-ТИРОИД» для дифференциальной диагностики ФА и ФР, который схематично представлен на рис. 8.

 

Рис. 8. Процесс разработки тест-системы «миР-ТИРОИД». ФА – фолликулярная аденома; ФР – фолликулярный рак; ОТ-ПЦР – реакция обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией

Fig. 8. The development process of the miR-THYROID test-system. FA – follicular adenoma; FC – follicular carcinoma; RT-PCR – reverse transcription with following polymerase chain reaction

 

В нашем случае этот процесс занял более 7 лет, так как включал исследования, результаты которых не нашли практического применения, и был сопряжен с решением ряда методологических и организационных вопросов. Полученный опыт позволяет предположить, что при правильном планировании аналогичные тест-системы на основе анализа микроРНК для решения других клинических задач могут быть разработаны в течение 2–3 лет. При этом важно понимать, что результаты, полученные с помощью разных аналитических технологий, могут не совпадать. Большая часть молекул, выбранных на основе глубокого секвенирования, была исключена из работы на последующих этапах. В то же время 3 реципрокные пары, формируемые miR-24-3p, имеют высокий диагностический потенциал лишь при анализе с помощью ОТ-ПЦР, но не глубокого секвенирования (см. рис. 6). В целом существующие технологии анализа микроРНК еще далеки от совершенства, поэтому отбор потенциально маркерных молекул целесообразно начинать с широкого «профайлинга» и проводить тем методом, который в дальнейшем планируется использовать в диагностической тест-системе.

Ограничения исследования. Основным ограничением исследования представляется незначительный размер коллекции образцов биологического материала (n = 40). Имевшаяся коллекция образцов позволяла оценить диагностический потенциал технологии анализа микроРНК, но не обеспечивала возможность разработки и валидации надежного метода интерпретации результатов ПЦР. Комплексная оценка результатов количественного анализа нескольких взаимосвязанных маркеров может быть выполнена с учетом многих параметров и с применением методов машинного обучения [33], но эти подходы требуют использования относительно больших баз данных и многочисленных коллекций биологических образцов. В представленном исследовании применен аналитический алгоритм, адаптированный к небольшому количеству образцов, который включал определенную последовательность действий:

1. определение значений ratio для 9 реципрокных пар маркерных микроРНК;
2. нормализацию этих показателей в рамках исследуемой группы образцов;
3. вычисление для каждого образца среднего арифметического 9 специфических значений ratio. Полученное таким образом значение и являлось параметром «миР-Т».

Предполагалось, что диагностический параметр «миР-Т», отражающий комплексные изменения экспрессии 7 маркерных молекул микроРНК, будет иметь диагностический потенциал, что и было доказано. Для усовершенствования метода анализа и интерпретации результатов ПЦР предполагается провести дополнительные исследования, сформировать более репрезентативную когорту образцов и разработать более «аккуратные» аналитические алгоритмы.

Перспективы клинического применения. Показатели диагностической значимости тест-системы «миР-ТИРОИД» и других технологий, разработанных для вспомогательной диагностики узлов ЩЖ III–IV категории по системе Bethesda, представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Показатели диагностической значимости тест-систем для анализа материала тонкоигольной аспирационной биопсии узлов щитовидной железы III–IV категории по системе Bethesda

Table 2. Diagnostic performance indicators of test systems for the analysis of fine needle aspiration material from thyroid nodules with Bethesda III–IV cytological diagnoses

Тест-система Test system	Категория по системе Bethesda* Category per the Bethesda system*	Число образцов, n Number of samples, n	Чувствительность Sensitivity	Специфичность Specificity	ППЗ PPS	ОПЗ NPS	Источник References
7-генная панель 7-gene panel test	III	86	67	64	43	83	[5]
	IV	34	67	90	80	82	[5]
	III–IV	131	48	95	67	91	[6]
	III–IV	112	86	77	54	94	[7]
ThyroSeq v3	III–IV	74	–	–	78	76	[8]
	III	127	96	48	–	92	[34]
	IV		92	44	–	78	[34]
	III–IV	60	100	31	54	100	[35]
Afirma-GSC	III–IV	70	97	36	63	91	[35]
	III–IV	–	99	27	30	91	[36]
ThyGeNEXTThyraMIR	III–IV	–	89	85	66	96	[36]
	III–IV	47	57	65	–	–	[16]
ThyroidPrint	III–IV	270	91	88	78	95	[13]
mir-THYpe	III–IV	168	89	82	66	95	[14]
«миР-ТИРОИД»	IV	40	89	90	89	90	–
*III категория по системе Bethesda – атипия неясного значения/ фолликулярное поражение, IV категория по системе Bethesda – фолликулярная неоплазия/подозрение на фолликулярную неоплазию. Примечание. ППЗ – положительное прогностическое значение; ОПЗ – отрицательное прогностическое значение. *Category III per the Bethesda system is atypia of undetermined significance/follicular lesion; category IV per the Bethesda system is follicular neoplasm/suspicious for follicular neoplasm. Note. PPS – positive prognostic significance; NPS – negative prognostic significance.

 

Важной характеристикой является баланс чувствительности и специфичности, который выгодно отличает «миР-ТИРОИД» от таких тест-систем, как 7-генная панель, ThyroSeq v3 и Afirma-GSC/GEC. Сравнение этой технологии с тест-системами, основанными на ОТ-ПЦР-анализе панелей молекул мРНК (ThyroidPrint) или микроРНК (mir-THYpe), демонстрирует сопоставимые результаты. В целом можно констатировать, что каждый из разработанных методов предполагает диагностические ошибки. Их число и потенциальный вред здоровью пациентов могут быть снижены при четком понимании ограничений каждой технологии. Тест-система «миР-ТИРОИД» разработана для решения задачи дифференциальной диагностики ФА и ФР, поэтому она должна применяться только в случае цитологического диагноза «фолликулярная неоплазия» (категория IV по системе Bethesda). Другие методы, представленные в табл. 2, имеют более широкие показания к применению. Кроме того, использование набора «миР-ТИРОИД» предполагает определенную серую зону значений параметра «мир-Т». Для безопасного применения этой тест-системы в клинической практике эта зона должна быть четко ограничена, что потребует дополнительных исследований.

Возможности оптимизации. Как показали представленные результаты, набор «миР-ТИРОИД» не идеален, но у разработчиков есть понимание путей его оптимизации. Во-первых, любые эпигенетические (в нашем случае – экспрессионные) изменения имеют количественный характер, поэтому их максимальная диагностическая эффективность может быть обеспечена расширением панели и сочетанием маркеров разной природы. Так, использование набора «миР-ТИРОИД» в сочетании с анализом генетических мутаций или экспрессии других типов РНК (мРНК, пивиРНК) может повысить его диагностический потенциал или расширить область его применения. Во-вторых, алгоритм интерпретации результатов ПЦР-анализа панели маркеров может быть оптимизирован с помощью методов машинного обучения. Как уже отмечалось, для эффективной реализации этих технологий необходимы большие массивы экспериментальных данных. Поэтому для оптимизации тест-системы «миР-ТИРОИД» нужно использовать набор в тестовом режиме, накапливать базу данных, разрабатывать и совершенствовать аналитические алгоритмы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Внедрение в медицинскую практику методов анализа новых диагностических маркеров является длительным процессом, который включает решение технических, организационных и клинических вопросов. Разработка технологии анализа микроРНК и алгоритма интерпретации его данных является предметом молекулярной онкологии. Результаты этой работы представлены в настоящей статье. В соответствии с приказом Росздравнадзора от 05.12.2024 № 6903 в Национальном медицинском исследовательском центре онкологии им. Н. Н. Петрова организовано производство тест-системы «миР-ТИРОИД» и начато его применение в клинической практике, что является первым шагом в решении организационных задач.

Проделанная нами работа дает возможность для решения клинических вопросов, включая обоснование показаний к применению тест-системы «миР-ТИРОИД», оценку клинической и экономической целесообразности ее использования и разработку соответствующих клинических рекомендаций. В случае успеха итоги финального этапа внедрения данного набора будут представлены в научных публикациях в течение ближайших лет.

About the authors

A. V. Shalaev

N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia

Email: anastasia@malek.com.ru
ORCID iD: 0000-0002-6148-6994
Russian Federation, 68 Leningradskaya St., Pesochny Settlement, Saint Petersburg 197758

L. M. Zabegina

N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia

Email: anastasia@malek.com.ru
ORCID iD: 0000-0003-0827-1641
Russian Federation, 68 Leningradskaya St., Pesochny Settlement, Saint Petersburg 197758

M. S. Aleksandrova

N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia

Email: anastasia@malek.com.ru
ORCID iD: 0000-0002-2079-5061
Russian Federation, 68 Leningradskaya St., Pesochny Settlement, Saint Petersburg 197758

P. A. Lokteva

N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia

Email: anastasia@malek.com.ru
ORCID iD: 0009-0001-8720-5062
Russian Federation, 68 Leningradskaya St., Pesochny Settlement, Saint Petersburg 197758

Ya. A. Bandyk

LLC “Algimed-Techno”

Email: anastasia@malek.com.ru
ORCID iD: 0000-0001-6148-6778
Belarus, 22/1 Logoysky Trakt, Minsk 220090

L. A. Krasil’nikova

N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia

Email: anastasia@malek.com.ru
Russian Federation, 68 Leningradskaya St., Pesochny Settlement, Saint Petersburg 197758

A. G. Kulyash

N.I. Pirogov Clinic of High Medical Technologies, Saint Petersburg State University

Email: anastasia@malek.com.ru
ORCID iD: 0000-0002-9916-6232
Russian Federation, 154 Fontanka River Emb., Saint Petersburg 192071

S. L. Vorob’ev

LLC “National Center of Clinical Morphological Diagnostics”

Email: anastasia@malek.com.ru
ORCID iD: 0000-0002-7817-9069
SPIN-code: 5920-0603
Russian Federation, 32 Slavy Prospekt, Saint Petersburg 192071

R. A. Chernikov

N.I. Pirogov Clinic of High Medical Technologies, Saint Petersburg State University

Email: anastasia@malek.com.ru
ORCID iD: 0000-0002-3001-664X
Russian Federation, 154 Fontanka River Emb., Saint Petersburg 192071

I. V. Sleptsov

N.I. Pirogov Clinic of High Medical Technologies, Saint Petersburg State University

Email: anastasia@malek.com.ru
ORCID iD: 0000-0002-1903-5081
Russian Federation, 154 Fontanka River Emb., Saint Petersburg 192071

A. V. Malek

N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia

Author for correspondence.
Email: anastasia@malek.com.ru
ORCID iD: 0000-0001-5334-7292
Russian Federation, 68 Leningradskaya St., Pesochny Settlement, Saint Petersburg 197758

References

Supplementary files