Overexpression of ABC transporters in gastrointestinal stromal tumors as one of the mechanisms for the development of secondary chemoresistance

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что большинство гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО) характеризуется экспрессией c-KIT (CD117) и наличием активирующих мутаций, локализованных либо в одноименном гене, либо, реже, в гене PDGFRA. Несмотря на то что иматиниба мезилат (ИМ) обеспечивает частичный ответ или стабилизацию заболевания у 80 % пациентов с ГИСО даже на поздней стадии заболевания, полный и продолжительный терапевтический ответ встречается в редких случаях из-за развития резистентности к препарату.

В настоящее время в литературе описано довольно большое количество механизмов формирования вторичной резистентности ГИСО к ИМ, среди которых в первую очередь выделяют вторичные мутации в генах KIT или PDGFRA [1–3] и активацию многочисленных альтернативных сигнальных путей, обеспечивающих выживаемость опухолевых клеток и сохранение их высокого пролиферативного потенциала на фоне ингибирования KIT- или PDGFRA-сигнальных путей [4–7]. Другим фактором, способствующим развитию вторичной резистентности многих разновидностей злокачественных опухолей к химиопрепаратам, может являться усиление их экскреции из опухолевых клеток за счет усиленной активности ABC-транспортеров [8, 9]. В частности, показано, что винкаалкалоиды, антрациклины, эпиподофиллотоксины и таксаны являются cубстратами преимущественно для ABCB1, в то время как «откачка» топотекана и иринотекана из опухолевых клеток осуществляется в основном через ABCG2 [10, 11]. Помимо вышеуказанных классических химиопрепаратов, нарушающих метаболизм опухолевых клеток и/или обладающих довольно неспецифическим ДНК-повреждающим действием, вызывающим гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза вследствие невозможности репарации данных повреждений ДНК, таргетные препараты также могут выступать в качестве субстратов для АВС-транспортеров. Например, резистентность опухолевых клеток у пациентов с хроническим миелолейкозом к таргетному препарату ИМ может являться следствием гиперэкспрессии P-гликопротеин (P-gp, MDR1), что снижает внутриклеточную концентрацию данного препарата в клетках опухоли и обеспечивает формирование их резистентности [12–15]. В то же время ИМ может оказывать ингибирующее влияние на активность некоторых АВС-транспортеров, что приводит к задержке химиопрепаратов (например, паклитаксела, доксорубицина) и восстанавливает чувствительность клеток к этим лекарственным средствам [16, 17]. Подобный офф-таргетный эффект в отношении AВС-транспортеров не является специфичным для ИМ и описан в отношении многих ингибиторов тирозинкиназ (ИТК) (как рецепторных, так и нерецепторных) [18].

Гиперэкспрессия ABC-транспортеров в раковых стволовых клетках (СК) также является одним из факторов их резистентности к химиопрепаратам [19–21], поэтому обнаружение повышенной экспрессии данных транспортеров в опухолях может являться косвенным признаком наличия в них клеток с фенотипом стволовости и обусловливать прогрессирование заболевания на фоне проводимой химиотерапии.

В связи с вышеизложенным представляют интерес изучение уровня экспрессии основных типов ABC-транспортеров в ИМ-резистентных клеточных линиях ГИСО и в случае обнаружения их гиперэкспресии оценка их роли в экскреции химиопрепаратов и формировании химиорезистентности ГИСО. Одной из задач исследования являлось определение маркеров стволовости в ИМ-резистентных клеточных линиях ГИСО.

Цель исследования – оценка экспрессии АВС-транспортеров (ABCB1/MDR1, АВСС1/MRP1 и ABCG2/BCRP), внутриклеточного содержания их флуоресцентных субстратов, а также маркеров стволовости в чувствительных к ИМ и резистентных к нему клеточных линиях ГИСО и их роли в резистентности к химиопрепаратам.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные линии и условия их культивирования. В исследовании использовались опухолевые клеточные линии ГИСО T-1, ГИСО T-1R, ГИСО 430 и HCC 1806 Tx-R. Их характеристика представлена в табл. 1.

 

Таблица 1. Характеристика клеточных линий гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО), использованных в исследовании

Table 1. Characteristic of the gastrointestinal stromal tumors (GIST) cell lines used in the study

Клеточная линия Cell line	Происхождение Origin	Мутационный статус Mutational status	Источник Reference
ГИСО T-1 GIST T-1	Линия, полученная из метастаза ГИСО человека Line derived from human GIST metastasis	Первичная мутация в виде делеции 57 оснований (V570-Y578) в 11-м экзоне гетерозиготного гена KIT Primary mutation in the form of deletion of 57 bases (V570-Y578) in exon 11 of heterozygous KIT	[22]
ГИСО T-1R GIST T-1R	Сублиния, полученная при длительном культивировании клеток ГИСО T-1 в присутствии постепенно возрастающих концентраций иматиниба мезилата (ИМ) Subline obtained by long-term culturing of GIST T-1 cell in the presence of gradually increasing concentrations of imatinib mesylate (IM)	Вторичных мутаций в гене KIT не обнаружено No secondary KIT mutations were detected	[23]
ГИСО 430 GIST 430	Линия, полученная из метастаза ГИСО человека после терапии ИМ Line derived from human GIST metastasis after IM therapy	Первичная гетерозиготная мутация в 11-м экзоне гена KIT (V560_L576del) и вторичная гетерозиготная миссенс-мутация в 13-м экзоне гена KIT (V654A) Primary heterozygous mutation in KIT exon 11 (V560_L576del) and secondary heterozygous missense mutation in KIT exon 13 (V654A)	[4]
HCC 1806 Tx-R	Сублиния, полученная при длительном культивировании клеточной линии трижды негативного рака молочной железы HCC 1806 в присутствии постепенно возрастающих концентраций паклитаксела Subline obtained by long-term culturing of triple negative breast cancer HCC1806 cell line in the presence of gradually increasing concentrations of paclitaxel	–	[24]

 

Клеточные линии ГИСО T-1, ГИСО T-1R и HCC 1806 Tx-R культивировали в среде RPMI-1640 («ПанЭко», Россия) с добавлением 10–15 % эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США), 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Культуральная среда для клеточной линии ГИСО 430 также содержала экстракт бычьего гипофиза (bovine pituitary extract, BPE) (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США) и биодобавку MITO+ (Corning, США). Все клеточные линии культивировали в условиях CO₂-инкубатора (LamSystems, Россия), поддерживающего уровень СО₂ в пределах 5 % и температурный режим – 37 °C.

Антитела и химические соединения. В исследовании использованы химиопрепараты доксорубицин (S1208; Selleck Chemicals, США) и митоксантрон (70476-82-3; Sigma-Aldrich, Merck, Германия), а также ингибиторы АВС-транспортеров тариквидар, циклоспорин А, Ко-143 и МК-571 (Selleck Chemicals, США). Все химические соединения были растворены в диметилсульфоксиде (ДМСО) в соответствии с рекомендациями производителя.

Для вестерн-блот-анализа использовали первичные антитела к ABCG2 (sc-58222; Santa Cruz, США), ABCB1/MDR-1 (sc-55510; Santa Cruz, США), BCRP1/MRP1 (ab260038; Abcam, США) и к β-актину-HRP (A00730-200; GenScript, США). Для детекции применяли вторичные антитела (sc-2004 и sc-2005; Santa Cruz, США).

Вестерн-блот-анализ. Образцы для иммуноблоттинга готовили путем лизирования клеток, достигших конфлюэнтности в пределах 90–100 %. Для лизирования клеток использовали буфер RIPA (25 мм Tris-HCl; рН 7,6; 150 мм NaCl; 5 мм этилендиаминтетрауксусной кислоты; 1 % NP-40; 1 % дезоксихолата натрия; 0,1 % натрия додецилсульфата с добавлением ингибиторов протеаз и фосфатаз. Клеточные лизаты инкубировали в течение 20 мин при температуре 4 °C, а затем осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 13 000 об/мин при температуре 4 °C. Нормализацию содержания белка в исследуемых образцах проводили с помощью набора BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Для электрофореза образцы, содержащие 30 мкг белка, погружали в 3–8 % трис-ацетатный гель NuPAGE (Invitrogen, США), переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, США), инкубировали со специфическими антителами и выполняли детекцию с использованием хемилюминесцентной реакции (реагент Western Lightning Plus-ECL, США). Денситометрический анализ изображений, полученных методом вестерн-блоттинга, проводили с помощью программного обеспечения NIH Image J (Bethesda, США).

Проточная цитометрия. Для анализа интенсивности флуоресценции субстратов для АВС-транспортеров, а также экспрессии маркеров стволовости методом проточной цитометрии клетки предварительно обрабатывали трипсином для получения клеточной суспензии и осаждали центрифугированием (1500 об/мин – 3 мин). После отмыва клетки (1 × 10⁶ клеток/мл) ресуспензировали в холодном фосфатном буфере с добавлением 1 % эмбриональной телячьей сыворотки. Оценку экспрессии маркеров стволовости проводили путем окрашивания клеток моноклональными антителами к CD133 (372810; Biolegend, США) и CD44 (338808; Biolegend, США) в течение 30 мин при 37 °С.

Для оценки функциональной активности АВС-транспортеров использовали автофлуоресцирующие субстраты: родамин 123 (62669 70-9, № 275545; Abcam, США), доксорубицин и митоксантрон. После обработки клеток трипсином их ресуспензировали в 500 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). В дальнейшем добавляли родамин 123 в концентрации 3 мкМ и инкубировали 1 ч при 37 °С. Далее клетки отмывали холодным PBS и повторно инкубировали в присутствии ингибиторов АВС-транспортеров (тариквидара, циклоспорина А, Ко-143, МК-571) в концентрации 1 мкМ и без их добавления (контроль) при той же температуре в течение 2 ч. Оценка внутриклеточного накопления двух других субстратов (доксорубицина или митоксантрона) проводилась после инкубации клеток с добавлением 10 мкМ вышеуказанных ингибиторов АВС-транспортеров [25] (2 ч, 37 °С) и без их добавления (контроль), с последующей заменой питательной среды на новую с добавлением 40 мкМ доксорубицина или митоксантрона [26, 27] (1 ч, 37 °С), с дальнейшей заменой питательной среды на новую с добавлением 10 мкМ ингибиторов АВС-транспортеров (2 ч, 37 °С). Далее клетки обрабатывали трипсином и осаждали центрифугированием (1500 об/мин – 5 мин) (центрифуга Liston C2204, Россия). Клеточную суспензию промывали, растворяли в холодном PBS в объеме 500 мкл и анализировали на проточном цитометре BD FACSCanto II (Becton Dickinson Biosciences, США) с использованием программного обеспечения BD FACSDiva 7.0.

Анализ колониеобразования. Для проведения анализа колониеобразования в адгезивных условиях клетки высевали в количестве 500 клеток на чашку Петри p100, инкубировали 12–14 сут, фиксировали 70 % этанолом и окрашивали красителем Гимза («ПанЭко», Россия). Количество и размер колоний рассчитывали с помощью программы Total Lab v2.0 с использованием модуля Colony Counter (Nonlinear Dynamics).

Количественная полимеразная цепная реакция. Клетки линий ГИСО T-1, ГИСО T-1R и ГИСО 430 культивировали в чашках Петри p100, после достижения 100 % конфлюентности обрабатывали трипсином, переносили в 15 мл пробирку, осаждали центрифугированием 1500 об/мин 3 мин (центрифуга Liston C2204, Россия) и трижды отмывали холодным PBS. Реагент тризол (BC032; Thermo Fisher Scientific, США) использовали для выделения общей РНК в соответствии с протоколом производителя и повторно суспензировали в воде без РНКаз (Qiagen, США). РНК подвергали обратной транскрипции в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (SK021; Евроген, Россия) в соответствии с протоколом производителя и далее проводили количественную полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Для нее использовали в общей сложности 1 мкл матричной кДНК с 5-кратным qPCRmix-HS SYBR («Евроген», Россия) и прямым и обратным праймерами (по 10 ммоль каждого). Последовательности праймеров представлены в табл. 2. Условия термоциклирования, использованные в этом исследовании, приведены в опубликованной нами ранее работе [24]. Количественная ПЦР выполнена с использованием системы детекции в реальном времени CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). Анализы для каждого опытного образца обработаны параллельно с эталонным геном GAPDH, относительные уровни каждой матричной РНК (мРНК) нормализованы относительно GAPDH. Затем для расчета относительной экспрессии каждого гена использовали метод ∆∆Ct [28].

 

Таблица 2. Праймеры для количественной полимеразной цепной реакции

Table 2. Primers for quantitative polymerase chain reaction

Ген Gene	Прямой праймер Forward primer	Обратный праймер Reverse primers
GAPDH	GACCACAGTCCATGCCATCA	TCCACCACCCTGTTGCTGTA
ALDH1A1	TGTTAGCTGATGCCGACTTG	TTCTTAGCCCGCTCAACACT
ALDH1A2	TGATCCTGCAAACACTGCTC	CTGGAGCTGGGTGGTAAGAG
ALDH1A3	TCTCGACAAAGCCCTGAAGT	TATTCGGCCAAAGCGTATTC
ALDH1B1	CTGGAGCTGGGTGGTAAGAG	CTTTCTCCACGGTTCTCTCG
ALDH1L2	GCCTGGTCTCGTTACCAAAA	GCCACTTTCACCTCTTCAGC
SOX2	CGAGTGGAAACTTTGTCGGA	TGTGCAGCGCTCGCAG

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

На начальном этапе исследования обнаружено, что в ИМ-резистентной линии клеток ГИСО 430, у которых развитие резистентности к ИМ было обусловлено вторичными мутациями в гене KIT, имеется значительная популяция клеток с низким уровнем флуоресценции красителя родамина 123 (11,2 %), что может свидетельствовать о его усиленной экскреции из опухолевых клеток. В то же время численность популяции клеток с низким уровнем флуоресценции данного красителя в ИМ-чувствительной клеточной линии ГИСО Т-1 (0,9 %) и ИМ-резистентной сублинии ГИСО T-1R (1,2 %) была крайне низкой. Среднее количество клеток с низкой экспрессией родамина 123 в вышеуказанных линиях ГИСО представлено на рис. 1.

 

Рис. 1. Среднее количество клеток с низким уровнем экспрессии флуоресцентного красителя родамина 123 в линиях гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО) Т-1, Т-1R и 430. Клетки инкубировали в присутствии родамина 123 (3 мкМ) и без него (контроль) в течение 1 ч. Клетки с низким уровнем флуоресценции родамина 123 выделены в гейт Р2 и обозначены синим цветом. SSC-A – площадь бокового светорассеивания; FITC-A – интенсивность флюоресценции флуоресцеин-5-изотиоцианата

Fig. 1. Average number of low-level cells with low expression level of the fluorescent dye rhodamine 123 in gastrointestinal stromal tumors (GIST) T-1, T-1R, and 430 lines. The cells were incubated in the presence of rhodamine 123 (3 μM) and without (control) him for 1 hour. Cells with low intensity of rhodamine 123 fluorescence are highlighted in gate P2 and are marked in blue. SSC-A – side scatter area; FITC-A – fluorescein-5-isothiocyanate fluorescence intensity

 

С учетом того что родамин 123 является мишенью для основных типов ABC-транспортеров, в том числе ABCB1 (P-gp) и ABCC1 (MRP1) [29–33], снижение интенсивности его флуоресценции в ИМ-резистентных клетках ГИСО 430 могло быть следствием усиленной экскреции данного красителя через вышеназванные АВС-транспортеры. Для изучения этой возможности проведен анализ уровней экспрессии основных типов АВС-транспортеров, таких как ABCB1/MDR1, АВСС1/MRP1 и ABCG2/BCRP, в вышеуказанных клеточных линиях ГИСО. В качестве положительного контроля использована клеточная сублиния трижды негативного рака молочной железы НСС 1806, резистентная к некоторым химиопрепаратам, в том числе к паклитакселу. Данная сублиния получена в нашей лаборатории при культивировании опухолевых клеток линии НСС 1806 с постепенно увеличивающимися концентрациями паклитаксела, а формирование резистентности к данному химиопрепарату явилось следствием его усиленной экскреции из опухолевых клеток вследствие гиперэкспрессии основных типов АВС-транспортеров [24]. Результаты вестерн-блоттинга, представленные на рис. 2, иллюстрируют гиперэкспрессию всех вышеназванных типов АВС-транспортеров в клеточной линии ГИСО 430, при этом наиболее значимым изменением была гиперэкспрессия MRP1. Экспрессия данных АВС-транспортеров не определялась в ИМ-чувствительной линии ГИСО Т-1. В ИМ-резистентной сублинии ГИСО Т-1R уровень экспрессии всех вышеуказанных транспортеров не отличался от их фоновых значений в материнской линии ГИСО Т-1 (см. рис. 2).

 

Рис. 2. Экспрессия ABC-транспортеров (ABCB1, ABCC1 и ABCG2) в клеточных линиях гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО) Т-1, ГИСО Т-1R, ГИСО 430 и HCC 1806 Tx-R (положительный контроль с высоким уровнем экспрессии ABC-транспортеров). Результаты вестерн-блоттинга (а) и денситометрического анализа экспрессии ABCB1 (б), ABCC1 (в) и ABCG2 (г). β-актин использовался в качестве контроля белковой нагрузки

Fig. 2. Expression level of ABC-transporters (ABCB1, ABCC1 и ABCG2) in gastrointestinal stromal tumors (GIST) T-1, T-1R, 430 and HCC 1806 Tx-R (positive control with high ABC-transporters expression) lines. Western blotting results (a) and densitometry analysis of ABCB1 (б), ABCC1 (в) and ABCG2 (г) expression are shown. β-actin was used as protein loading control

 

С учетом обнаруженного нами факта гиперэкспрессии основных типов АВС-транспортеров в ИМ-резистентной клеточной линии ГИСО 430 (см. рис. 2) и значительного снижения интенсивности флуоресценции родамина 123 в определенной популяции данных клеток (см. рис. 1) в дальнейшем проведено изучение механизмов экскреции данного красителя из клеток ГИСО 430, культивированных в присутствии ингибиторов циклоспорина А и тариквидара (ингибиторы P-gp), МК-571 (ингибитор МRP1) и Ко-143 (ингибитор BCRP). В ГИСО 430, культивированных с родамином 123 в отсутствие ингибиторов АВС-транспортеров, численность популяции родамин-отрицательных клеток составила 3,5 %. Данные, представленные на рис. 3 и в табл. 3, свидетельствуют о том, что экскреция данного флуоресцентного субстрата из клеток ГИСО происходит через P-gp, что подтверждено снижением количества опухолевых клеток с низкой экспрессией родамина 123 в присутствии циклоспорина А (1,4 %) и тариквидара (1,8 %). В то же время ингибитор MRP1 (МК-571) не оказывал влияния на количество родамин-отрицательных клеток (3,3 %). Парадоксальный эффект обнаружен в отношении ингибитора BCRP, в присутствии которого происходило примерно 3-кратное увеличение количества клеток с низким уровнем флуоресценции красителя (9,8 %), что могло свидетельствовать о способности Ko-143 стимулировать активность других ABC-транспортеров.

 

Рис. 3. Влияние ингибиторов АВС-транспортеров на интенсивность свечения родамина 123 в клетках гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО) линии 430 без ингибиторов АВС-транспортеров (а) и в присутствии ингибиторов АВС-транспортеров: тариквидара (б), циклоспорина А (в), МК-571 (г) и Ко-143 (д). Клетки инкубировали в присутствии родамина 123 в концентрации 3 мкМ в течение 1 ч без добавления ингибиторов АВС-транспортеров и с дальнейшим внесением в питательную среду указанных выше ингибиторов (1 мкМ) на 2 ч. Клетки с низким уровнем флуоресценции родамина 123 выделены в гейт Р5 и обозначены синим цветом. SSC-A – площадь бокового светорассеивания; FITC-A – интенсивность флюоресценции флуоресцеин-5-изотиоцианата

Fig. 3. The effect of ABC-transporters inhibitors on the fluorescence intensity of rhodamine 123 in gastrointestinal stromal tumors (GIST) 430 cell line without ABC transporter inhibitors (control) (a); under the influence of ABC-transporters inhibitors tariquidar (б), cyclosporine A (в), MK-571 (г), Ko-143 (д). The cells were incubated in the presence of rhodamine 123 at a concentration of 3 μM for 1 hour without ABC transporter inhibitors (control) and with the further addition of aforementioned inhibitors (1 μM) for 2 hours. Cells with low level of rhodamine 123 fluorescence are highlighted in gate P5 and are marked in blue. SSC-A – side scatter area; FITC-A – fluorescein-5-isothiocyanate fluorescence intensity

 

Таблица 3. Изменение количества клеток с низким уровнем экспрессии флуоресцентного красителя родамина 123 в клетках гастроинтестинальных стромальных опухолей линии 430 под влиянием ингибиторов ABC-транспортеров

Table 3. Change in quantity of cells with low expression level of the fluorescent dye rhodamine 123 in gastrointestinal stromal tumors 430 cell line under influence of ABC-transporters inhibitors

Группа Group	Количество родамин-отрицательных клеток, % (M ± SD) Quantity of rhodamine-negative cells, % (M ± SD)
Контроль Control	3,5 ± 0,4
Тариквидар Tariquidar	1,8 ± 0,3*
Циклоспорин А Cyclosporine A	1,4 ± 0,1**
МК-571	3,3 ± 0,5
Ко-143	9,8 ± 1,1**
*p <0,05. **p <0,01. Примечание. M – среднее значение; SD – стандартное отклонение. Note. M – average; SD – standard deviation.

 

Эксперименты с использованием химиопрепаратов, обладающих свойствами автофлуоресценции, также показали роль вышеуказанных транспортеров в формировании резистентности клеток ГИСО 430 к этим лекарственным средствам путем усиления их экскреции из опухолевых клеток. Например, внутриклеточное накопление доксорубицина значительно увеличивалось на фоне ингибирования в опухолевых клетках белка MRP1, в то время как ингибиторы P-gp и BCRP не оказывали аналогичного эффекта (рис. 4), что демонстрирует ведущую роль МRP1 в экскреции данного препарата из клеток ГИСО 430 и коррелирует с обнаруженной нами ранее гиперэкспрессией белка МRP1 в этих клетках (см. рис. 2).

 

Рис. 4. Изменение внутриклеточного содержания доксорубицина в клетках гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО) линии 430. Показаны интенсивность свечения доксорубицина (40 мкМ) в клетках ГИСО 430, культивированных без (сплошная линия) и в присутствии одного из ингибиторов АВС-транспортеров (пунктирная линия). Ингибиторы АВС-транспортеров тариквидар, циклоспорин А, МК-571 и Ко-143 (10 мкМ) вносили в клеточную культуру на 2 ч до добавления доксорубицина (40 мкМ) и культивировали в течение последующих 3 ч после внесения данного химиопрепарата в клеточную культуру. PE-A – интенсивность флуоресценции фикоэритрина (PE)

Fig. 4. Change in intracellular accumulation of doxorubicin in gastrointestinal stromal tumors (GIST) 430 cell line. The intensity of fluorescence of doxorubicin (40 μM) in GIST 430 cells cultured without (solid line) and in presence of inhibitors of ABC-transporters: tariquidar, cyclosporine A, MK-571, Ko-143 (dotted line). The inhibitors of ABC-transporters (10 μM) were introduced in the cell culture for 2 h prior doxorubicin exposure and further cultured in presence of doxorubicin for 3 h. The axis x shows changes in the fluorescence intensity of the chemotherapeutic drug, and the axis y shows the number of analyzed events. PE-A – phycoerythrin (РЕ) fluorescence intensity

 

В свою очередь, интенсивность флуоресценции митоксантрона в ИМ-резистентных клетках ГИСО 430 усиливалась в присутствии селективного ABCB1-ингибитора тариквидара, в то время как остальные ингибиторы оказывали менее выраженный эффект (рис. 5).

 

Рис. 5. Изменение интенсивности свечения митоксантрона (40 мкМ) в клетках гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО) линии 430, культивированных без (сплошная линия) и в присутствии одного из ингибиторов АВС-транспортеров (пунктирная линия). Ингибиторы АВС-транспортеров тариквидар, циклоспорин А, МК-571 и Ко-143 (10 мкМ) вносили в клеточную культуру на 2 ч до добавления митоксантрона (40 мкМ) и культивировали в течение последующих 3 ч в присутствии данного химиопрепарата. PE-A – интенсивность флуоресценции фикоэритрина (РЕ)

Fig. 5. Change in Intracellular accumulation of mitoxantrone in gastrointestinal stromal tumors (GIST) 430 cell line. The intensity of fluorescence of mitoxantrone (40 μM) in gastrointestinal stromal tumors (GIST) 430 cell line cultured without (solid line) and in presence of inhibitors of ABC-transporters: tariquidar, cyclosporine A, MK-571, Ko-143 (dotted line). The inhibitors of ABC-transporters (10 μM) were introduced in the cell culture for 2 h prior mitoxantrone exposure and further cultured in presence of mitoxantrone for 3 h. The axis x shows changes in the fluorescence intensity of the chemotherapeutic drug, and the axis y shows the number of analyzed events. PE-A – phycoerythrin (РЕ) fluorescence intensity

 

Таким образом, получены доказательства способности различных типов АВС-транспортеров экскретировать доксорубицин и митоксантрон из опухолевых клеток ГИСО. Изменения интенсивности флуоресценции данных химиопрепаратов представлены в табл. 4.

 

Таблица 4. Интенсивность флуоресценции доксорубицина и митоксантрона в клетках гастроинтестинальных стромальных опухолей линии 430, инкубированной в присутствии ингибиторов ABC-транспортеров, среднее значение ± стандартное отклонение

Table 4. Fluorescence intensity of doxorubicin and mitoxantrone in gastrointestinal stromal tumors 430 cell line incubated in the presence of ABC-transporters inhibitors, average ± standard deviation

Группа Croup	Интенсивность флуоресценции доксорубицина Fluorescence intensity of doxorubicin	Интенсивность флуоресценции митоксантрона Fluorescence intensity of mitoxantrone
Контроль Control	888 ± 72	3731 ± 133
Тариквидар Tariquidar	885 ± 74	4810 ± 140*
Циклоспорин А Cyclosporine A	771 ± 69	4188 ± 132**
МК-571	3915 ± 130*	4227 ± 129**
Ко-143	791 ± 81	4141 ± 127**
*p <0,001. **p <0,05.

 

Полученные данные об усилении экскреции доксорубицина и митоксантрона из опухолевых клеток ГИСО 430 коррелировали со значениями их полумаксимальных ингибирующих концентраций (IC₅₀), свидетельствующих о существенном их увеличении по сравнению с клетками ГИСО линии T-1 (табл. 5).

 

Таблица 5. Значения полумаксимальных ингибирующих концентраций (IC₅₀) этопозида, доксорубицина, митоксантрона в клеточных линиях гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО) T-1, T-1R и 430 (мкМ) (кратность увеличения IC₅₀ относительно ГИСО Т-1)

Table 5. Half maximal inhibitory concentration (IC₅₀) values for etoposide, doxorubicin and mitoxantrone in gastrointestinal stromal tumors (GIST) T-1, T-1R and 430 cells lines (magnification factor of IC₅₀ compared with GIST T-1)

Препарат Drug	ГИСО T-1 GIST T-1	ГИСО T-1R GIST T-1R	ГИСО 430 GIST 430
Этопозид Etoposide	43 ± 1	146 ± 7 (3,4)	101 ± 3 (2,4)
Доксорубицин Doxorubicin	0,2 ± 0,1	0,4 ± 0,1 (1,8)	2,4 ± 0,3 (10,0)
Митоксантрон Mitoxantrone	0,1 ± 0,05	1,0 ± 0,2 (7,4)	3,3 ± 0,7 (25,2)

 

Таким образом, помимо общеизвестных вторичных мутаций в гене KIT в клетках ГИСО 430, повышенная экспрессия различных типов АВС-транспортеров также могла явиться причиной их резистентности к таргетному препарату ИМ, что свидетельствует о многообразии молекулярных механизмов резистентности, формирующихся на едином клеточном уровне. К сожалению, на данный момент сравнительная оценка внутриклеточного содержания данного таргетного препарата в ИМ- чувствительных и ИМ-резистентных клеточных линиях ГИСО аналогичным методом не представляется возможной вследствие отсутствия доступных конъюгатов ИМ с флуоресцентыми метками.

С учетом того что обнаруженная нами в линии ГИСО 430 повышенная экспрессия АВС-транспортеров могла быть признаком наличия клеток с признаками стволовости [21, 34], изучена возможность их присутствия в данной клеточной линии.

Поскольку известны способности СК к самообновлению, самоподдержанию и образованию колоний, изучена способность ИМ-резистентных клеточных линий ГИСО 430 и Т-1R к колониеобразованию в присутствии ИМ и без него. Обнаружено увеличение численности колоний в клеточной культуре линии ГИСО 430, которое наблюдалось после внесения ИМ. Этот эффект был специфичным для клеток линии ГИСО 430 (рис. 6), что может свидетельствовать о наличии в указанной клеточной линии пула опухолевых клеток с фенотипом стволовости и объяснять повышенный уровень экскреции флуоресцентных субстратов, в том числе родамина 123, и химиопрепаратов доксорубицина и митоксантрона из данных опухолевых клеток по сравнению с ИМ-чувствительными клетками линии T-1 и ИМ-резистентными клетками сублинии T-1R.

 

Рис. 6. Влияние иматиниба мезилата (ИМ) на способность клеточных линий гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО) к колониеобразованию: а – колониеобразование в адгезивных условиях клеточных линий ГИСО T-1R и ГИСО 430. Инкубация клеток с ИМ в концентрации 1 мкМ в течение 48 ч; б – количество сформированных колоний на 500 клеток в клетках ГИСО T-1R и ГИСО 430, инкубированных в присутствии диметилсульфоксида (контроль) или ИМ (1 мкМ) в течение 48 ч (б)

Fig. 6. The effect of imatinib mesylate (IM) on the colony-forming capacity of gastrointestinal stromal tumor (GIST) cell lines: а – сolony formation in GIST T-1R and GIST 430 cells. Incubation of cells with IM at a concentration of 1 µM for 48 h; б – quantification of the colonies (500 cells) in GIST T-1R and GIST 430 cells treated with dimethyl sulfoxide (control) or IM (1 µM) for 48 h (б)

 

На заключительном этапе исследований проведен сравнительный анализ экспрессии молекул CD133 и CD44, являющихся маркерами СК различного происхождения [35, 36]. Различий в уровне экспрессии данных молекул между ИМ-чувствительной и ИМ-резистентной линиями Т-1 обнаружено не было (рис. 7), что коррелировало с отсутствием различий в количестве клеток с низким уровнем экспрессии родамина 123 между данными опухолевыми клеточными линиями. Вопреки ожиданиям, уровень экспрессии СD133 в клеточной линии ГИСО 430 оказался значительно ниже по сравнению с линией ГИСО Т-1 (см. рис. 7, а), а экспрессия CD44 отсутствовала (см. рис. 7, б). Экспрессия вышеуказанных маркеров СК на 3 клеточных линиях ГИСО представлена в табл. 6.

 

Рис. 7. Экспрессия маркеров стволовости CD133 (а) и CD44 (б) в клетках гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО). PE-A – интенсивность флуоресценции фикоэритрина (РЕ)

Fig. 7. Expression of CD133 (а) and CD44 (б) stem markers in gastrointestinal stromal tumors (GIST) cells. PE-A – phycoerythrin (РЕ) fluorescence intensity

 

Таблица 6. Экспрессия CD133 и CD44 в клеточных линиях гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО), %

Table 6. Expression of CD133 and CD44 in gastrointestinal stromal tumors (GIST) cells, %

Клеточная линия Cell line	Местоположение мутаций Locus of mutation	Чувствительность к иматиниба мезилату Sensitivity to imatinib mesylate	Уровень экспрессии CD133 CD133 expression level	Уровень экспрессии CD44 CD44 expression level
ГИСО T-1 GIST T-1	Экзон 11 Exon 11	Да Yes	94 ± 2	44 ± 1
ГИСО T-1R GIST T-1R	Экзон 11 Exon 11	Нет No	93 ± 3	49 ± 3
ГИСО 430 GIST 430	Экзоны 11 и 13 Exons 11 and 13	Нет No	46 ± 2	0

 

Помимо этого, не обнаружено значимого повышения уровня экспрессии большинства форм альдегиддегидрогеназы 1-го типа (ALDH1) (ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L2) в клетках ГИСО 430 по сравнению с ИМ-чувствительными клетками линии ГИСО Т-1 и резистентными клетками сублинии ГИСО T-1R (табл. 7). Напротив, для большинства изоформ ALDH1 отмечалось снижение экспрессии мРНК ALDH1 в клетках ГИСО 430 по сравнению с ИМ-чувствительной линией Т-1, что подтверждало отсутствие значимого пула СК в данной опухолевой линии ГИСО.

 

Таблица 7. Кратность изменения экспрессии матричной РНК ALDH1 и SOX2 в клеточных линиях гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО) T-1R и ГИСО 430 по сравнению с ГИСО Т-1

Table 7. Fold change in ALDH1 and SOX2 messenger RNA expression in gastrointestinal stromal tumors (GIST) T-1R and GIST 430 cell lines compared with GIST T-1

Клеточная линия Cell lines	ALDH1A1	ALDH1A2	ALDH1A3	ALDH1B1	ALDH1L2	SOX2
ГИСО T-1R GIST T-1R	1,8*; p = 0,03	1,4; p = 0,5	2,3*; p = 0,02	1,9; p = 0,09	0,7; p = 0,2	3,8**; p = 0,0002
ГИСО 430 GIST 430	0,04**; p = 0,0001	2,0; p = 0,07	0,02**; p = 0,0004	0,01**; p = 0,0003	1,4; p = 0,4	0,002*; p = 0,005
*p <0,05. **p <0,001.

 

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют об усилении экскреции химиопрепаратов из опухолевых клеток ГИСО 430 вследствие гиперэкспресии АВС-транспортеров, что иллюстрирует многообразие механизмов формирования химиорезистентности даже в относительно однородной клеточной популяции опухолевых клеток. Помимо этого, на основании результатов колониеобразования, показавших увеличение численности колоний в ГИСО 430 после внесения в культуру ИМ, нельзя окончательно исключить наличие в культуре ГИСО 430 опухолевых клеток с фенотипом стволовости, что в совокупности со вторичными мутациями в гене KIT и гиперэкспрессией ABC-транспортеров может быть дополнительным фактором формирования их химиорезистентности.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты нашего исследования продемонстрировали гиперэкспрессию 3 основных типов ABC-транспортеров в ИМ-резистентной клеточной линии ГИСО 430 (см. рис. 2), что могло явиться одним из механизмов их резистентности к доксорубицину и митоксантрону (см. табл. 5). Использование специфических ингибиторов ABCB1 (тариквидара и циклоспорина А), АВСС1 (МК-571) и ABCG2 (Ко-143) приводило к значимому повышению интенсивности внутриклеточной флуоресценции вышеуказанных химиопрепаратов в данной клеточной линии ГИСО. Мы обнаружили, что ключевым транспортером, ответственным за экскрецию доксорубицина из опухолевых клеток ГИСО 430, был транспортер АВСС1 (см. рис. 4), в то время как снижение внутриклеточной концентрации митоксантрона в этих клетках ГИСО осуществлялось преимущественно через ABCB1-опосредованный механизм (см. рис. 5). Активация функции ABC-транспортеров в данной клеточной линии также подтверждалась значимым снижением интенсивности флуоресценции родамина 123, являющегося субстратом преимущественно для транспортера ABCB1 (см. рис. 1).

Обнаруженный нами факт экспрессии АВС-транспортеров в ИМ-резистентной клеточной линии ГИСО 430 мог также быть следствием наличия в данной клеточной линии клеток с фенотипом стволовости. Действительно, активность АВС-транспортеров в СК наиболее высока по сравнению с опухолевыми клетками [37–39]. Для изучения такой возможности мы проанализировали уровни экспрессии некоторых маркеров СК в указанной клеточной линии ГИСО, а именно провели сравнительный анализ экспрессии молекул CD133 и CD44 и некоторых изоформ ALDH1. Экспрессия CD133 (также известного как проминин-1) широко используется при комплексной диагностике некоторых разновидностей злокачественных опухолей [40, 41]. Известно, что CD133 представляет собой трансмембранный белок пентаспан, который первоначально был описан как поверхностный антиген, специфичный для гемопоэтических, нейрональных и других СК человека [42]. Хотя биологическая функция CD133 остается неясной, CD133 сам по себе или в комбинации с другими маркерами в настоящее время используется для выделения СК из множества нормальных тканей, а также для идентификации и выделения предполагаемой популяции опухолевых СК из различных злокачественных новообразований, включая глиомы и эпителиальные опухоли [43].

Вопреки ожиданиям, уровень экспрессии CD133 в клетках линии ГИСО 430 был ниже по сравнению с ИМ-резистентными клетками ГИСО T-1R, а также их материнской ИМ-чувствительной линией ГИСО Т-1 (см. рис. 7, а, табл. 6). Более того, экспрессия СD44 в клетках ГИСО 430 вообще не определялась, но была крайне высокой в линии ГИСО Т-1 (см. рис. 7, б, табл. 6). К тому же не обнаружено различий в уровне экспрессии вышеуказанных маркеров стволовости между ИМ-чувствительной и резистентной линиями ГИСО Т-1 и Т-1R (см. табл. 6). Полученные данные не позволяют сделать предположение о наличии клеток с фенотипом стволовости в клеточной линии ГИСО 430, несмотря на установленный нами ранее факт усиления колониеобразования в геле, характерный исключительно для клеточной линии ГИСО 430 [44]. В данном исследовании была также выявлена способность таргетного препарата ИМ стимулировать образование колоний в ГИСО 430 (см. рис. 6).

Известно, что способность к колониеобразованию является одним из свойств как нормальных, так и опухолевых СК и позволяет выявить их в популяции. При оценке различий в количестве колоний между использованными клеточными линиями ГИСО следует принимать во внимание не общее количество всех колоний, которые указывают на общую жизнеспособность клеток в условиях теста, а именно истинные фокусы клеточной пролиферации – крупные плотные колонии, которые и должны быть образованы опухолевыми СК. С учетом этих данных вышеописанные изменения обнаружены исключительно в клеточной популяции ГИСО 430, культивированной в присутствии ИМ, что может свидетельствовать о способности данного таргетного препарата влиять на прогрессирование заболевания в случае развития химиорезистентности опухолевых клеток.

Для исключения возможности присутствия в клеточной линии ГИСО 430 клеток с фенотипом стволовости также проведена оценка уровня экспрессии некоторых изоформ ALDH1. Известно, что ALDH1 является детоксицирующим ферментом, ответственным за окисление внутриклеточных альдегидов. Данный фермент обеспечивает устойчивость к некоторым алкилирующим агентам, достаточно широко используемым в терапии различных злокачественных новообразований [45]. Кроме того, ALDH1 участвует в метаболизме ретинола в ретиноевую кислоту, что приводит к запуску клеточной дифференцировки в СК, в связи с чем данный маркер используют при их сортировке [46]. Во многих исследованиях показано, что ALDH1⁺-опухолевые клетки проявляют радиорезистентность; имеются также доказательства запуска эпителиально-мезенхимального перехода и экспрессии соответствующих маркеров, таких как Snail. Следовательно, высокая экспрессия ALDH1 может расцениваться как один из довольно специфических маркеров СК [47]. Роль ALDH1 в резистентности ГИСО к ИМ и прогрессировании заболевания остается малоизученной. Имеются единичные исследования, свидетельствующие о том, что гиперэкспрессия ALDH1A и некоторых других генов (например, CD34, FGF2, KIT, JAG1) коррелирует с диссеминацией опухолевого процесса, метастатическими поражениями печени и низкими показателями безрецидивной выживаемости [48]. Полученные нами данные, представленные в табл. 7, демонстрируют низкий уровень экспрессии мРНК всех изученных изоформ ALDH1, а также SOX2 в клеточной линии ГИСО 430 по сравнению с ИМ-резистентной линией ГИСО Т-1R и их материнской ИМ-чувствительной линией ГИСО Т-1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты настоящего исследования свидетельствуют о большой роли гиперэкспрессии некоторых разновидностей АВС-транспортеров в формировании резистентности ГИСО к химиопрепаратам. Также необходимо учитывать ранее опубликованные данные, в том числе нашей научной группы, демонстрирующие цитотоксическую и противоопухолевую активность некоторых химиопрепаратов (в частности, ингибиторов ДНК-топоизомеразы 2-го типа) в отношении ГИСО, в том числе резистентных к ИМ [49–51]. Роль гиперэкспрессии вышеуказанных ABC-транспортеров в резистентности ГИСО к ИМ является объектом будущих исследований, предусматривающих конъюгацию этого препарата с соответствующими флуоресцентыми метками и последующее определение его внутриклеточной концентрации с помощью проточной цитометрии и/или других методических подходов (например, с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии).

About the authors

F. F. Bikinieva

Kazan State Medical University, Ministry of Health of Russia

Email: boichuksergei@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9012-6525
Russian Federation, 49 Butlerova St., Kazan 420012

P. D. Dunaev

Kazan State Medical University, Ministry of Health of Russia

Email: boichuksergei@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5449-4435
Russian Federation, 49 Butlerova St., Kazan 420012

A. R. Galembikova

Kazan State Medical University, Ministry of Health of Russia

Email: boichuksergei@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0293-2974
Russian Federation, 49 Butlerova St., Kazan 420012

Т. V. Gessel

Kazan State Medical University, Ministry of Health of Russia

Email: boichuksergei@mail.ru
ORCID iD: 0009-0003-4348-9141
Russian Federation, 49 Butlerova St., Kazan 420012

P. B. Kopnin

Research Institute of Carcinogenesis, N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia

Email: boichuksergei@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2078-4274
Russian Federation, 24 Kashirskoye Shosse, Moscow 115522

E. S. Egorova

Central Research Laboratory, Kazan State Medical University, Ministry of Health of Russia

Email: boichuksergei@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6210-4660
Russian Federation, 49 Butlerova St., Kazan 420012

S. А. Ryzhkin

Russian Medical Academy of Continuing Professional Education, Ministry of Health of Russia; Department of Medical and Biological Sciences, Tatarsran Academy of Sciences

Email: boichuksergei@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2595-353X
Russian Federation, Bld. 1, 2/1 Barricadnaya St., Moscow 125993; 20 Baumana St., Kazan 420111

S. V. Boichuk

Kazan State Medical University, Ministry of Health of Russia; Central Research Laboratory, Kazan State Medical University, Ministry of Health of Russia; Russian Medical Academy of Continuing Professional Education, Ministry of Health of Russia; Department of Medical and Biological Sciences, Tatarsran Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: boichuksergei@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2415-1084
Russian Federation, 49 Butlerova St., Kazan 420012; 49 Butlerova St., Kazan 420012; Bld. 1, 2/1 Barricadnaya St., Moscow 125993; 20 Baumana St., Kazan 420111

References

Supplementary files