Epithelial-mesenchymal transition in high grade serous ovarian cancer cells

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Ключевым механизмом прогрессии опухолей эпителиального происхождения (карцином) является эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП). В ходе этого процесса клетки теряют признаки эпителиального фенотипа и приобретают свойства мезенхимальных клеток. Вступая в ЭМП, эпителиальные клетки утрачивают апикально-базальную полярность, стабильную межклеточную адгезию, в клетках резко снижается или полностью исчезает экспрессия эпителиальных маркеров и начинают экспрессироваться мезенхимальные маркеры (виментин, N-кадхерин, фибронектин и др.). Клетки, вступившие в ЭМП, приобретают способность к миграции и инвазии [1, 2].

В последнее время представления об ЭМП в опухолях изменились. Выяснилось, что он может быть динамичным и обратимым процессом, при этом опухоли представляют собой гетерогенные клеточные популяции, в которых клетки способны вступать в неполный (частичный) ЭМП, реализующийся с помощью различных программ. Клетки карцином могут продолжать экспрессировать эпителиальные маркеры, включать и мезенхимальные маркеры, и их соотношение способно меняться, что влияет на адаптацию опухолевых клеток к условиям микроокружения, характер клеточной диссеминации и чувствительность к химиотерапии [3–5].

Серозный рак яичников высокой степени злокачественности (high grade ovarian serous cancer, HGSOC) является наиболее часто встречающейся карциномой яичников (более 75 % случаев рака яичников), имеет агрессивный характер, активно метастазирует и рецидивирует, приобретая устойчивость к химиопрепаратам [6]. Как показало транскриптомное и протеомное профилирование, HGSOC в большинстве случаев возникает из секреторных клеток фимбриального отдела маточных труб. Ранним генетическим нарушением в секреторных клетках является мутация в гене TP53, что приводит к развитию серозной тубулярной интраэпителиальной карциномы, эволюционирующей в HGSOC [7–11]. Клетки HGSOC диссеминируют в яичник и брюшную полость, где циркулируют в асцитической жидкости в виде сфероидов [12]. Опухолевые клетки карцином яичников инвазируют мезотелий брюшины, направляясь чаще всего в большой сальник, а также метастазируют в парааортальные лимфатические узлы и органы брюшной полости [13, 14].

В литературе имеются сообщения об изменениях экспрессии Е-кадхерина и маркеров ЭМП, в частности мезенхимального маркера виментина, в опухолевой ткани рака яичников [15, 16]. Вместе с тем детальных исследований, посвященных анализу изменений характера структур межклеточной адгезии, цитоскелетных структур, локализации белков межклеточной адгезии и контактов с подлежащим матриксом в клетках HGSOC, до настоящего времени не проводилось. Для анализа особенностей ЭМП в HGSOC мы использовали коррелятивную видеомикроскопию и иммунофлуоресцентную микроскопию первичных культур HGSOC, которая позволяет сопоставить миграционные характеристики клеток с организацией их цитоскелетных систем, регулирующих миграцию, распределением белков межклеточной адгезии, фокальных адгезий между клетками и подлежащим матриксом.

Цель исследования – изучение миграционной активности и систем цитоскелета клеток первичных опухолевых культур HGSOC, полученных из операционного материала больных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение первичных культур опухолевых клеток HGSOC. Первичные культуры опухолевых клеток получали из образцов опухолевой ткани от пациенток с раком яичников. Образцы измельчали механически до получения фрагментов объемом 1–2 мм³. Полученную клеточную суспензию высевали в культуральные флаконы в среду RPMI (Gibco, Великобритания), содержащую 15 % эмбриональной телячьей сыворотки (Biovest, США) и 100 МЕ/мл пенициллина/стрептомицина («ПанЭко», Россия). Клетки культивировали при 37 °С в атмосфере, содержащей 5 % CO₂, в течение 3–5 дней до достижения необходимой плотности.

Коррелятивная видеомикроскопия и иммунофлуоресцентная микроскопия. Клетки, выделенные из образца опухолевой ткани, высевали на меченые покровные стекла, помещенные в двухлуночные камеры ibidi со стеклянным дном (ibidi GmbH, Германия), и проводили прижизненную цейтраферную видеосъемку клеток (1 кадр/5 мин) в течение 20 ч с помощью микроскопа Nikon Eclipse Ti-E, оснащенного объективом Nikon Plan 20× и камерой ORCA-ER (Hamamatsu Photonics, Япония), управляемой с помощью программного обеспечения NIS-Elements AR 3.22 (Nikon, Япония). Первичные параметры миграции клеток определяли с помощью программного обеспечения Fiji/ImageJ (v.2.9.0, NIH, США), далее с использованием Microsoft Excel 2016 (Microsoft, США) рассчитывали скорость миграции клеток и длину траектории.

После видеосъемки клетки фиксировали для иммунофлуоресцентного окрашивания цитокератина (CK) 7 или СК18, Е-кадхерина и виментина. Для фиксации использовали 1 % параформальдегид (Sigma-Aldrich, США), приготовленный на среде DMEM с 20 мМ HEPES. Клетки фиксировали при комнатной температуре в течение 15 мин с последующей дофиксацией метанолом в течение 3 мин при температуре –20 °C. Также проводили дополнительное флуоресцентное окрашивание Е-кадхерина и N-кадхерина, винкулина, α-катенина и F-актина клеток, растущих на немеченых стеклах. Для окрашивания винкулина, α-катенина и F-актина клетки фиксировали 3,7 % параформальдегидом (Sigma-Aldrich, США) с последующей пермеабилизацией 0,25 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich, США) в течение 3 мин. Все антитела и красители использовали в разведениях, соответствующих рекомендациям производителя. Образцы исследовали с помощью микроскопа Nikon Eclipse Ti-E, оснащенного объективом Nikon Plan 40× и камерой ORCA-ER (Hamamatsu Photonics, Япония).

Антитела и реагенты. Использовали следующие первичные антитела: мышиные моноклональные антитела к Е-кадхерину (клон 36; BD Transduction Laboratories, США), мышиные моноклональные антитела к N-кадхерину (клон 32; BD Transduction Laboratories, США), кроличьи антитела к виментину (D21H3; Cell Signaling, США), мышиные моноклональные антитела к CK18 (клон СК5; Sigma-Aldrich, США), мышиные моноклональные антитела к винкулину (клон hVIN-1; Sigma, Merck, Германия), мышиные антитела к α-катенину (клон 15D9; Enzo Life Sciences, США). В качестве вторичных антител применяли антитела козы к мышиным иммуноглобулинам (Ig) G1, IgG2a, IgG2b и антитела козы к мышиному и кроличьему IgG, конъюгированные с Alexa Fluor488, Alexa Fluor594 или Alexa Fluor647 (Jackson ImmunoResearch, США). Ядра клеток метили красителем DAPI (Sigma-Aldrich, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Коррелятивная видеомикроскопия и иммунофлуоресцентная микроскопия. Для исследования особенностей ЭМП клеток HGSOC использованы первичные культуры, полученные из операционного материала 26 онкологических больных, диагноз которых подтвержден патоморфологическим исследованием. Клетки опухолевых образцов переведены в культуру и росли на меченых стеклах, помещенных в двухлуночные камеры ibidi со стеклянным дном (ibidi GmbH, Германия). Через 3–5 дней после начала культивирования исследовали фенотип и поведение опухолевых клеток в 10 полях зрения на протяжении 20 ч, после чего клетки фиксировали для иммунофлуоресцентного окрашивания CK7 или CK18, Е-кадхерина и виментина.

С помощью программы ImageJ для 10–20 клеток из каждого сюжета построены траектории движения клеток и определены средние скорости миграции. Предлагаемый подход позволяет исследовать миграционную активность опухолевых клеток, особенности их фенотипа с последующим анализом наличия и распределения эпителиальных и мезенхимальных маркеров, цитоскелетных структур и белков межклеточной адгезии в этих клетках.

На рис. 1 представлен пример опухолевой культуры, полученной из образца П368 опухолевой ткани HGSOC. Клетки опухоли обладали мезенхимальным фенотипом: имели полигональную или треугольную форму и образовывали ламеллиподии на ведущем крае. Клетки также могли принимать выгнутую кератоцитоподобную форму с одной широкой ведущей ламеллиподией. Большинство клеток активно мигрировали по поверхности субстрата, иногда останавливаясь и меняя направление движения. Как показало иммунофлуоресцентное окрашивание белков промежуточных филаментов, опухолевые клетки экспрессировали СК7, который был организован в сеть; в центральной части клетки кератиновые филаменты собирались в жгуты, плотно окружающие клеточное ядро. Также клетки первичной культуры опухолевого образца П368 экспрессировали виментин, собирающийся в филаменты, которые образовывали сеть, распространяющуюся из центра клетки на периферию.

 

Рис. 1. Коррелятивная видеомикроскопия и иммунофлуоресцентная микроскопия, масштаб 100 мкм. Клетки первичной культуры опухолевого образца П368 на меченом стекле снимали с использованием дифференциальной интерференционной контрастной (differential interference contrast, DIC) видеомикроскопии (а) в течение 21 ч. На рис. а (последний кадр) приведена траектория движения клетки, отмеченной звездочкой. Далее клетки фиксировали и проводили иммунофлуоресцентное окрашивание цитокератина 17 (СК7), виментина и клеточных ядер. Отснятое на видео поле находили в DIC-канале (б). СК7 (отмечено зеленым цветом), виментин (отмечено красным цветом) и ядра (отмечено синим цветом) выявляли в соответствующих каналах флуоресцентного микроскопа. Траектории движения 10 случайно выбранных клеток показаны на итоговой диаграмме (в)

Fig. 1. Correlative video microscopy and immunofluorescence microscopy, scale 100 microns, scale, 100 µm. Tumor sample #П368. Live cell differential interference contrast (DIC) imaging (а) during 21 h. Fig. a (the last frame) shows the trajectory of the cell marked with an asterisk. Next, the cells were fixed and immunofluorescence staining of cytokeratin 7 (CK7), vimentin, and cell nuclei was performed. The field captured on video was found in the DIC channel (б). CK7 (green), vimentin (red) and nuclei (blue) were detected in the corresponding channels of a fluorescence microscope. The trajectories of 10 randomly selected cells are shown in the final diagram (в)

 

Виды миграции клеток первичных культур HGSOC. Результаты видеомикроскопического исследования первичных культур показали, что ЭМП в клеточных популяциях HGSOC проявляется неравномерно. В большинстве опухолей значительная доля клеток вступила в ЭМП, т. е. имела высокий потенциал к метастазированию. Многие клетки в культуре проявляли высокую миграционную активность, большинство из них мигрировали индивидуально, используя мезенхимальный тип миграции. Средняя скорость миграции составила около 0,5 мкм/мин. Иногда клетки могли изменять форму и округляться. Такие клетки легко откреплялись от субстрата.

В образцах также наблюдались островки клеток, в которых опухолевые клетки сохраняли связь друг с другом. Такие островки могли оставаться неподвижными или немного перемещаться по субстрату, а из них – выходить группы из 2–3 клеток или одиночные клетки, которые мигрировали индивидуально или через какое-то время возвращались и прикреплялись к островку. Некоторые островки были более рыхлыми, в них наблюдалась направленная миграция нескольких сцепленных между собой клеток (коллективная миграция) (рис. 2).

 

Рис. 2. Индивидуальная и коллективная миграция клеток серозного рака яичников высокой степени злокачественности. Прижизненная дифференциальная интерференционная контрастная (differential interference contrast, DIC) видеомикроскопия первичных опухолевых культур, масштаб 100 мкм. Представлены кадры из соответствующих видеосюжетов: a – образец П326. Индивидуально мигрирующая клетка отмечена звездочкой. Траектория ее движения за 5 ч активной миграции указана синей линией на последнем кадре; б – образец П305. Большинство клеток распластаны и сцеплены, мигрируют коллективно в составе островка. Клетка на краю островка, помеченная звездочкой, отрывается от него и мигрирует индивидуально. Траектория ее движения за 5 ч указана синей линией на последнем кадре

Fig. 2. Individual and collective migration of high grade serous ovarian cancer cells. Live cell differential interference contrast (DIC) imaging of primary tumor cultures, scale, 100 µm. Frames from relevant videos are shown: а – tumor sample П326. An individually migrating cell is indicated by an asterisk. Its 5-hour long active migration track is shown in blue on the last frame; б – tumor sample П305. The majority of the cells form a collectively migrating island. These cells are well spread and linked together. A cell breaks away from the island and migrates individually (indicated by an asterisk). Its 5-hour long migration track is shown in blue on the last frame

 

Реорганизация структур межклеточной адгезии опухолевых клеток. Для того чтобы клетки карцином начали мигрировать из первичного опухолевого узла, должны быть разрушены межклеточные адгезионные контакты (АК), обеспечивающие стабильную связь с соседними клетками, характерную для клеток эпителиального происхождения. В классической парадигме ЭМП ослабление межклеточной адгезии связано с угнетением экспрессии Е-кадхерина в результате действия транскрипционных факторов семейств Snail, Zeb и Twist. В наших исследованиях первичных культур HGSOC наблюдался спектр состояний ЭМП: от сохранения Е-кадхерина в стабильных тангенциальных (линейных) АК в островках вплоть до полной потери Е-кадхерина и его замены на мезенхимальный N-кадхерин в 2 образцах (рис. 3). В большинстве первичных культур в клетках, находящихся в контакте, отмечалась аккумуляция Е-кадхерина на мембране, однако, в отличие от линейных АК нормальных эпителиальных клеток, АК опухолевых клеток часто были точечными или штриховыми (радиальными). В АК также мог присутствовать N-кадхерин. Как показали результаты наших предыдущих исследований, такие контакты поддерживают межклеточную адгезию, но крайне нестабильны и быстро разрушаются при активации клеточной миграции, при этом клетки легко отрываются от соседних клеток и выходят из островков [17].

 

Рис. 3. Межклеточные адгезионные контакты (АК) клеток первичных культур серозного рака яичников высокой степени злокачественности. Иммунофлуоресцентное окрашивание E-кадхерина и N-кадхерина в клетках первичных культур, масштаб 25 мкм: а – клетки с коэкспрессией E-кадхерина (указано красным цветом) и N-кадхерина (указано зеленым цветом). Во врезках показаны различные типы межклеточных АК при большем увеличении: тангенциальные (врезка 1) и радиальные (врезка 2); б – клетки с потерей мембранной локализации E-кадхерина. E-кадхерин отсутствует в межклеточных контактах, N-кадхерин формирует радиальные межклеточные АК. Ядра окрашены DAPI (указано синим цветом). Во врезках – зона межклеточного контакта при большем увеличении

Fig. 3. Adherens junctions (AJs) in primary cultures of high grade serous ovarian cancer. Immunofluorescence analysis of E-cadherin and N-cadherin distribution in primary cultures, scale, 25 µm: а – cells express both E-cadherin (red) and N-cadherin (green). Different types of AJs are shown in inserts at higher magnification: tangential AJs (insert 1) and radial AJs (insert 2). Bottom row – cells with no discernible E-cadherin localization at the cell membrane. E-cadherin is absent from AJs; radial AJs are formed by N-cadherin. Cell-cell adhesion regions are shown in inserts at higher magnification. Cell nuclei were stained with DAPI (blue)

 

Цитоскелетные структуры опухолевых клеток. Миграция клеток, вступивших в ЭМП, определяется динамическими структурами цитоскелета. Движущей силой мезенхимальной миграции являются актиновые микрофиламенты, образующие Arp2/3-зависимую актиновую сеть на ведущем крае клетки и актин-миозиновые пучки, обеспечивающие сокращение тела клетки и отрыв хвостовой части для последующего перемещения клетки в направлении движения. С использованием меченного родамином фаллоидина в опухолевых клетках первичных культур HGSOC мы оценили распределение филаментного актина. Наиболее выраженная реорганизация актинового цитоскелета была характерна для клеток, мигрирующих индивидуально или выходящих из островков. Такие клетки собирали актиновую сеть, которая при флуоресцентной микроскопии визуализировалась как тонкая линия, окаймляющая ведущий край клетки. В цитоплазме видны прямые актиновые пучки, ориентированные вдоль длинной оси клетки (рис. 4, a). Мигрирующие клетки образовывали фокальные контакты с подложкой, что выявлено с использованием антител к одному из белков фокальных контактов – винкулину (см. рис. 4, б). Часть популяции клеток первичных культур HGSOC, образующих островки, могла сохранять организацию актинового цитоскелета, характерную для нормальных эпителиальных клеток, – кольцевые актиновые пучки, ассоциированные с межклеточными АК.

 

Рис. 4. Распределение структур актинового цитоскелета и адгезионных белков в клетках первичных культур серозного рака яичников высокой степени злокачественности: а, б – двойное флуоресцентное окрашивание актина и белка фокальных контактов винкулина. В клетке, выходящей из островка, на ведущем крае в виде тонкой линии собирается актиновая сеть, в цитоплазме формируются актиновые пучки, отходящие от фокальных контактов; в – флуоресцентное окрашивание α-катенина, который перераспределяется на край вновь образующихся ламеллиподий мигрирующих клеток. Во врезках – области при большем увеличении. Масштаб 10 мкм

Fig. 4. Intracellular distribution of structures of the actin cytoskeleton and adhesion proteins in cells of primary cultures of high-grade serous ovarian cancer: a, б – double fluorescent staining of actin and the focal adhesion protein of vinculin. In the cell breaking away from the island, an actin network polymerizes at the leading edge in the form of a thin line, actin bundles are formed in the cytoplasm, extending from the focal adhesions; в – fluorescent staining of α-catenin, which is redistributed to the edge of the newly formed lamellipodia of migrating cells. The inserts show the areas at a higher magnification. Scale, 10 µm

 

В мигрирующих клетках серозных карцином высокой степени злокачественности также наблюдалось перераспределение белка межклеточных АК α-катенина на ведущий край клетки (см. рис. 4, в). Феномен использования белков межклеточной адгезии для активации клеточной миграции мы впервые описали in vitro в культуре клеток линии IAR-20, входящих в динамичный ЭМП под действием эпидермального фактора роста (EGF) [18].

Наиболее типичным маркером ЭМП является виментин. С использованием мышиных моноклональных и кроличьих антител к виментину изучена его локализация в опухолевых клетках первичных культур образцов HGSOC. По результатам иммунофлуоресцентной микроскопии экспрессия виментина может индуцироваться не во всех опухолевых клетках. Гетерогенное окрашивание виментина характерно, в частности, для островков. В таких островках часть клеток лишена виментина, в то время как другие клетки не только экспрессировали этот белок, но и собирали его в протофиламенты или даже в полноценную цитоплазматическую сеть (рис. 5). Следует отметить, что, как показали коррелятивная видеомикроскопия и иммунофлуоресцентная микроскопия, в мигрирующих одиночных клетках, а также во многих клетках на краю островков есть сеть виментиновых промежуточных филаментов.

 

Рис. 5. Экспрессия виментина в клетках первичных культур серозного рака яичников высокой степени злокачественности. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание цитокератина 18 (CK18) и виментина, масштаб 10 мкм: а – цитокератиновая сеть заполняет всю цитоплазму и концентрируется вокруг ядра во всех клетках; б – гетерогенность сборки виментиновых промежуточных филаментов. Флажком помечена инициация сборки виментиновых филаментов, стрелкой – протофиламенты виментина, треугольником – собранная сеть виментиновых филаментов

Fig. 5. Expression of vimentin in primary cultures of high grade serous ovarian cancer. Double immunofluorescent staining for cytokeratin 18 (CK18) and vimentin, scale, 10 µm: а – cytokeratin filament network fills the entire cytoplasm with higher concentration of filaments in the juxtanuclear region in every cell; б – variability in the extent of vimentin intermediate filament network assembly. Arrowhead indicates initiation of vimentin intermediate filament network assembly, arrow, vimentin protofilaments, triangle, fully assembled vimentin intermediate filament network

 

Таким образом, исследование первичных опухолевых культур свидетельствует об индукции программ ЭМП в клетках HGSOC. Популяции опухолевых клеток отличались гетерогенностью выраженности маркеров ЭМП; клетки большинства образцов вступали в неполный ЭМП, сохраняя экспрессию Е-кадхерина и одновременно индуцируя экспрессию мезенхимальных маркеров. В активно мигрирующих опухолевых клетках была выражена сеть виментиновых промежуточных филаментов. Характерной особенностью клеток HGSOC с гибридным эпителиально-мезенхимальным фенотипом являлась радикальная реорганизация актинового цитоскелета и межклеточных АК. Также в опухолевых образцах наблюдалось разнообразие паттернов миграции клеток: они могли мигрировать строго индивидуально, строго коллективно или переходить из одного режима миграции в другой.

ОБСУЖДЕНИЕ

Как показали результаты исследований последних лет, программа ЭМП, запускающая инвазионно-метастатический каскад в опухолях эпителиального происхождения (карциномах), не может считаться переключателем, переводящим раковые клетки из эпителиального фенотипа в мезенхимальный. В большинстве своем опухолевые клетки вступают в неполный ЭМП и приобретают гибридный эпителиально-мезенхимальный фенотип, сохраняя частично экспрессию эпителиальных маркеров, но включая при этом экспрессию мезенхимальных маркеров. В различных опухолях ЭМП представляет собой совокупность изменений уровней экспрессии транскрипционных факторов ЭМП и регулирующих их микроРНК, компонентов сигнальных путей. Эти изменения в конечном счете позволяют опухолевым клеткам оторваться от соседних клеток в первичной опухоли, инвазировать подлежащую строму и мигрировать в организме с последующим образованием очагов вторичного роста (метастазов) [3–5, 19].

Видеомикроскопия первичных опухолевых культур представляет собой удобный подход in vitro для исследования фенотипа опухолевых клеток, анализа их межклеточных взаимодействий и изучения миграционной активности, лежащей в основе процессов инвазии и метастазирования. В данном исследовании для оценки особенностей ЭМП в HGSOC мы использовали коррелятивную видеомикроскопию и иммунофлуоресцентную микроскопию первичных культур HGSOC, которая позволяет сопоставить миграционные характеристики клеток и организацию их цитоскелетных систем, распределение белков межклеточной адгезии и фокальных адгезий.

Как показали результаты коррелятивной видеомикроскопии и иммунофлуоресцентной микроскопии, клетки HGSOC в первичных культурах демонстрировали признаки ЭМП. Культуры, полученные из опухолевых образцов, включали как островки клеток, так и одиночные мигрирующие клетки, экспрессирующие CKs. В ходе иммунофлуоресцентного исследования обнаружено, что клетки в островках сохраняли адгезивные взаимодействия, образуя АК. В большинстве образцов в таких контактах присутствовал Е-кадхерин; помимо этого в состав АК мог входить также N-кадхерин. При этом наблюдались различия в морфологии АК. В некоторых случаях это были тангенциальные (линейные) контакты; часто опухолевые клетки на межклеточных границах собирали точечные или штриховые (радиальные) АК. Ранее мы обнаружили принципиальные различия в стабильности, сборке и регуляции тангенциальных и радиальных АК [17]. Тангенциальные (линейные) Е-кадхериновые АК являются чрезвычайно стабильными структурами нормальных эпителиальных клеток, для их формирования требуется участие малой ГТФазы Rac и формина Dia1. Сборка радиальных (штриховых) Е-кадхериновых и N-кадхериновых АК регулируется малой ГТФазой Rho и ее эффектором ROCK и зависит от контрактильности актина-миозина. Радиальные АК крайне динамичны и нестабильны, они легко разбираются, что в значительной степени ослабляет межклеточные взаимодействия и позволяет активировать клеточную миграцию. Ранее на клетках линий IAR-20 и IAR-6-1 мы показали, что одним из механизмов ослабления межклеточной адгезии в ходе ЭМП является основанное на радикальной реорганизации актинового цитоскелета замещение тангенциальных АК радиальными АК, образованными Е-кадхерином [17, 20]. Реорганизация Е-кадхериновых АК наблюдалась также и в клетках первичных культур HGSOC, радиальные и точечные АК могли удерживать клетки в контакте, но также позволяли им довольно легко разрывать связи с соседними клетками и мигрировать индивидуально. В цитоплазме одиночных мигрирующих клеток HGSOC Е-кадхерин часто наблюдался в составе эндосом, что указывает на разборку предсуществующих АК.

Несмотря на то что традиционно Е-кадхерину в опухолях приписывают супрессорную роль, на нескольких мышиных моделях карцином молочной железы обнаружено, что сохранение его экспрессии способствует выживанию опухолевых клеток при метастазировании [21]. Результаты исследования in vitro клеток опухолевых линий также указывают на то, что Е-кадхерин может увеличить выживаемость опухолевых клеток, а его эктодомен – активировать в клетках онкогенный сигналинг и способствовать диссеминации опухолевых клеток [22–25]. Можно предположить, что в случае HGSOC Е-кадхерин может способствовать метастазированию клеток с гибридным эпителиально-мезенхимальным фенотипом, объединяя их в кластеры, повышающие адаптационные возможности клеток в эктопических условиях, в частности в асцитической жидкости брюшной полости, где клетки циркулируют в неприкрепленном состоянии.

Данные видеомикроскопических исследований свидетельствуют о высоком уровне миграционной активности клеток HGSOC, что указывает на высокий метастатический потенциал клеток исходной опухоли. В первичных культурах чаще всего наблюдалась рандомная миграция одиночных клеток; также одиночные клетки или группы из 2–3 клеток могли выходить из островков и активно мигрировать по субстрату. В 6 образцах наблюдалась миграция отдельных островков (коллективная миграция). Ранее мы показали, что миграция клеток в состоянии ЭМП активируется в результате радикальной перестройки актинового цитоскелета – разрушения кольцевых актиновых пучков, ассоциированных с АК, и смещения акцента сборки актиновой сети в ламеллиподии на межклеточных границах и на ведущем крае [20]. Реорганизация цитоскелетных структур и сборка актиновой сети в ламеллиподиях, определяющие выход клеток из островков и активную миграцию одиночных клеток, наблюдались и в клетках первичных культур HGSOC. На активном крае мигрирующих клеток также аккумулировался белок межклеточной адгезии α-катенин. При изучении ЭМП в нескольких клеточных линиях ранее мы обнаружили, что разрушение АК при ослаблении межклеточной адгезии сопровождается перераспределением α-катенина на ведущий край мигрирующих клеток. Показана значимая роль белков межклеточной адгезии в индукции направленной миграции [18]. В клетках HGSOC α-катенин также, по-видимому, участвует в регуляции клеточной миграции, поскольку его перераспределение из АК в ламеллиподии наблюдалось в первичных опухолевых культурах.

При анализе видеомикроскопических данных и последующей иммунофлуоресцентной микроскопии клеток первичных культур HGSOC, окрашенных на виментин, мы обнаружили, что характерной особенностью мигрирующих опухолевых клеток является наличие в их цитоплазме сети виментиновых промежуточных филаментов. Индукция экспрессии виментина также детектировалась в некоторых клетках островков. Распределение виментина при этом носило неравномерный характер, а степень сборки виментиновых промежуточных филаментов варьировала от коротких протофиламентов и полусобранной сети до разветвленной сети, заполняющей всю цитоплазму. Результаты исследования подтверждают многочисленные данные других авторов о присутствии виментина как маркера ЭМП в опухолевых клетках [1, 5]. Значение этого белка в мезенхимальной миграции показано в ряде работ [26], его участие в формировании и росте метастазов на мышиных моделях – в недавних исследованиях [27, 28]. Однако функциональная роль виментина и виментиновых промежуточных филаментов в миграции и инвазии опухолевых клеток до сих пор остается неясной и требует дальнейшего изучения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Все морфологические параметры клеток исследованных образцов HGSOC соответствуют частичному/неполному ЭМП, цитоскелетные механизмы которого основаны на радикальной реорганизации актинового цитоскелета и межклеточных АК. С учетом гибкости неполного ЭМП и пластичности гибридного фенотипа неполный ЭМП может быть оптимальной стратегией морфологической трансформации клеток HGSOC, способствующей инвазии и метастазированию.

About the authors

M. M. Voronova

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia

Email: n.gloushankova@ronc.ru
ORCID iD: 0009-0001-7806-6734
Russian Federation, 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115522

A. S. Ilnitskaya

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia

Email: n.gloushankova@ronc.ru
ORCID iD: 0000-0001-8925-440X
Russian Federation, 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115522

A. O. Zholudeva

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia

Email: n.gloushankova@ronc.ru
ORCID iD: 0000-0001-9659-770X
Russian Federation, 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115522

S. N. Rubtsova

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia

Email: n.gloushankova@ronc.ru
ORCID iD: 0000-0003-4620-7851
Russian Federation, 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115522

K. I. Zhordania

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia

Email: n.gloushankova@ronc.ru
ORCID iD: 0000-0003-1380-3710
Russian Federation, 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115522

A. Yu. Alexandrova

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia

Email: n.gloushankova@ronc.ru
ORCID iD: 0000-0001-5071-2290
Russian Federation, 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115522

N. A. Gloushankova

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia

Author for correspondence.
Email: n.gloushankova@ronc.ru
ORCID iD: 0000-0002-2044-2063
Russian Federation, 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115522

References

Supplementary files