Выявление мутаций в «горячих» участках генома: ампликоны-«шпильки» в методе плавления ДНК
Аннотация
Амплификация с последующим плавлением ДНК с зондами TaqMan эффективно выявляет мутации в «горячих» участках генома. Однако необходимость проводить полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в асимметричном варианте обусловливает ряд ограничений этого метода: 1) невозможность количественного анализа из‑за снижения эффективности амплификации; 2) необходимость выполнения 2 независимых ПЦР для выявления мутаций в комплементарных нитях ампликона; 3) усложнение дизайна ПЦР. Преодоление этих ограничений оказалось возможным при использовании в симметричной ПЦР комбинированных праймеров, состоящих из универсальной и специфической последовательностей: образующиеся в результате однонитевые «шпилечные» (hairpin) ампликоны (sense и antisense) не способны ренатурировать друг с другом, но независимо гибридизуются с присутствующими в среде зондами TaqMan (antisense и sense соответственно). Разработанный способ позволяет в одном тесте получить количественные (число копий) и качественные (наличие мутаций в обеих нитях ампликона) характеристики исследуемого участка ДНК.
Об авторах
В. Н. Кондратова
НИИ канцерогенеза ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Россия
Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Россия
Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
И. В. Ботезату
НИИ канцерогенеза ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Россия
Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Россия
Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
В. П. Шелепов
НИИ канцерогенеза ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Россия
Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Россия
Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
А. В. Лихтенштейн
НИИ канцерогенеза ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Россия
Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Россия
Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Список литературы
1. Prior I.A., Lewis P.D., Mattos C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Cancer Res 2012;72(10): 2457–67.
2. Yang W., Shelton D.N., Berman J.R. et al. Droplet digital™ PCR: multiplex detection of KRAS mutations in formalin-fixed, paraffin- embedded colorectal cancer samples. Biotechniques 2015;58:205–6.
3. Huang Q., Liu Z., Liao Y. et al. Multiplex fluorescence melting curve analysis for mutation detection with dual-labeled, selfquenched probes. PLoS One 2011;6(4):e19206.
4. Botezatu I.V., Nechaeva I.O., Stroganova A.M. et al. Optimization of melting analysis with TaqMan probes for detection of KRAS, NRAS and BRAF mutations. Anal Biochem 2015;491: 75–83.
5. Botezatu I.V., Nechaeva I.O., Stroganova A.M. et al. Asymmetric real-time PCR and multiplex melting curve analysis with TaqMan probes for detecting PIK3CA mutations. Data Brief 2015;5: 913–7.
6. Botezatu I.V., Panchuk I.O, Stroganova A.M. et al. TaqMan probes as blocking agents for enriched PCR amplification and DNA melting analysis of mutant genes. Biotechniques 2017;62(2):62–8.
7. Schutz E., von Ahsen N. Spreadsheet software for thermodynamic melting point prediction of oligonucleotide hybridization with and without mismatches. Biotechniques 1999;27(6):1218–22.
8. Orita M., Iwahana H., Kanazawa H. et al. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as singlestrand conformation polymorphisms. Proc Natl Acad Sci U S A 1989;86(8):2766–70.
9. Yap E.P., McGee J.O. Nonisotopic discontinuous phase single strand conformation polymorphism (DP-SSCP): genetic profiling of D-loop of human mitochondrial (mt) DNA. Nucleic Acids Res 1993;21:4155.
10. Guthrie P.A., Gaunt T.R., Abdollahi M.R. et al. Amplification ratio control system for copy number variation genotyping. Nucleic Acids Res 2011;39(8):e54.
Для цитирования:
Кондратова В.Н., Ботезату И.В., Шелепов В.П., Лихтенштейн А.В. Выявление мутаций в «горячих» участках генома: ампликоны-«шпильки» в методе плавления ДНК. Успехи молекулярной онкологии. 2017;4(1):46-52. https://doi.org/10.17650/2313-805X-2017-4-1-46-52
For citation:
Kondratova V.N., Botezatu I.V., Shelepov V.P., Lichtenstein A.V. Detection of gene mutations in genome “hot” spots: “hairpin” amplicons in DNA melting analysis. Advances in molecular oncology. 2017;4(1):46-52. (In Russ.) https://doi.org/10.17650/2313-805X-2017-4-1-46-52
Просмотров: 1447
Послать статью по эл. почте 