Background. The incidence of brain gliomas firmly occupies a leading position among all central nervous system tumors – 40–50 % of the cases detected, more than half of them are glioblastoma. Existing cell lines and cultivation methods do not reflect all the features of the three-dimensional (3D) organization of native glioblastoma. The use of temozolomide leads to the development of drug resistance and acute relapse, followed by a poor clinical outcome. The development of resistance is largely associated with the presence of tumor stem cells in the population and intratumoral heterogeneity. Obtaining 3D cultures from the primary material will allow us to save the stem cell pool and tumor-specific features.
The study objective. Get a 3D model based on primary cell cultures, which allows you to save a heterogeneous population and the original phenotype of tumor cells.
Materials and methods. We used U-87MG human glioma cells and GBM002 primary cell culture obtained from surgical material with a confirmed diagnosis of glioblastoma. Neurospheres were obtained from cell lines, the growth of which was monitored using the InCell Analyzer 6000 automatic cell analysis system. Flow cytometry was used to determine the CD133+ cell content. The expression of the receptor tyrosine kinases VEGFR1, VEGFR2 (endothelial growth factor type 1 and 2 receptors), FGFR2 (fibroblast growth factor receptor type 2) and the hypoxia marker HIF-1α (hypoxia inducible factor, 1α) in the neurospheres was evaluated using confocal microscopy.
Results. GBM002 glioblastoma cells isolated from the surgical material formed neurospheres, while the number of CD133+ cells increased from 1–2 to 16–19 % compared with two-dimensional cultures. During long-term cultivation of cells with non-cytotoxic doses of temozolomide, it was found that such cells form smaller neurospheres compared to control cells. It was shown that the expression of receptor tyrosine kinases during cultivation of GBM002 glioblastoma cells in neurospheres differs from that in two-dimensional cultures. We found that in neurospheres, the expression of FGFR2 and VEGFR1, is significantly increased.
Conclusion. 3D cultivation of primary cultures allows one to obtain a more heterogeneous population of tumor cells that reflects the spatial heterogeneity of cells, increase the pool of stem cells and recreate hypoxia conditions inside the brain micro-tumors.
Введение. Заболеваемость глиомами головного мозга прочно занимает лидирующую позицию среди всех опухолей центральной нервной системы – 40–50 % выявленных случаев, более половины из них представлены глиобластомой. Существующие клеточные линии и методы культивирования не отражают всех особенностей трехмерной (3D) организации нативной глиобластомы. Применение темозоломида приводит к развитию лекарственной устойчивости и острого рецидива с последующим плохим клиническим исходом. Развитие резистентности в значительной степени связано с наличием в популяции опухолевых стволовых клеток и внутриопухолевой гетерогенностью. Получение 3D-культур из первичного материала позволит сохранить пул стволовых клеток и специфические для конкретной опухоли особенности.
Цель исследования – получить 3D-модель на основе первичных клеточных культур, позволяющую сохранить гетерогенную популяцию и исходный фенотип опухолевых клеток.
Материалы и методы. Использованы клетки линии человеческой глиомы U-87MG и первичная клеточная культура GBM002, полученная из операционного материала, с подтвержденным диагнозом глиобластомы. Из клеточных линий были получены нейросферы, рост которых контролировали с помощью автоматической системы для клеточного анализа InCell Analyzer 6000. Для определения содержания клеток CD133+ использовали метод проточной цитометрии. Оценку экспрессии в нейросферах рецепторных тирозинкиназ VEGFR1, VEGFR2 (рецепторы эндотелиального фактора роста 1‑го и 2‑го типов), FGFR2 (рецептор фактора роста фибробластов 2‑го типа) и маркера гипоксии HIF-1α (фактор, индуцируемый гипоксией, 1α) проводили с помощью конфокальной микроскопии.
Результаты. Клетки глиобластомы GBM002, выделенные из операционного материала, образовывали нейросферы, при этом повышалось количество клеток CD133+ с 1–2 до 16–19 % по сравнению с двухмерными культурами. При длительном культивировании клеток с нецитотоксическими дозами темозоломида установлено, что такие клетки образуют нейросферы меньшего размера по сравнению с контрольными клетками. Показано, что экспрессия рецепторных тирозинкиназ при культивировании клеток глиобластомы GBM002 в нейросферах отличается от таковой в двухмерных культурах. Установлено, что в нейросферах в значительной степени увеличивается экспрессия FGFR2 и VEGFR1.
Заключение. 3D-культивирование первичных культур позволяет получать более гетерогенную популяцию опухолевых клеток, отражающую пространственную неоднородность клеток, повышать пул стволовых клеток и воссоздавать условия гипоксии внутри микроопухолей головного мозга.