Advances in Molecular OncologyAdvances in Molecular OncologyУспехи молекулярной онкологии2313-805X2413-3787Publishing House ABV Press25410.17650/2313-805X-2020-7-1-23-31RESEARCH ARTICLESЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИThe importance of preexisting drug resistance due to overexpression of P-glycoprotein for the formation of resistance to bortezomibЗначение предсуществующей лекарственной устойчивости, обусловленной гиперэкспрессией Р-гликопротеина, для формирования резистентности к бортезомибуhttps://orcid.org/0000-0002-8839-5881LaletinaL. A.ЛалетинаЛ. А.
Russian Federation

Build. 15, 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

Лидия Александровна Лалетина

115478 Москва, Каширское шоссе, 24, стр. 15

panlidia@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0001-6697-7154MoiseevaN. I.МоисееваН. И.
Russian Federation

Build. 15, 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24, стр. 15

https://orcid.org/0000-0003-2587-1761KaramyshevaA. F.КарамышеваА. Ф.
Russian Federation

Build. 15, 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24, стр. 15

Research Institute of Carcinogenesis, N. N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of RussiaНИИ канцерогенеза ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н. Н. Блохина» Минздрава России150120207123312803202028032020Copyright ©; 2020, Laletina L.A., Moiseeva N.I., Karamysheva A.F.Copyright ©; 2020, Лалетина Л.А., Моисеева Н.И., Карамышева А.Ф.2020Laletina L.A., Moiseeva N.I., Karamysheva A.F.Лалетина Л.А., Моисеева Н.И., Карамышева А.Ф.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://umo.abvpress.ru/jour/article/view/254

Objective of the study. In our work we investigated the effect of pre-existing drug resistance by the mechanism of activation of ABC transporters – P-glycoprotein (Pgp) overexpression – on the development of resistance to the proteasome inhibitor bortezomib.

Materials and methods. Cultures RPMI8226 and K562 / i-S9 (with Pgp overexpression) and their bortezomib-resistant sublines RPMI8226 / btz-6 and K562 / i-S9vlc were used as models. The methods used were MTT test, flow cytometry, Western blot and real-time polymerase chain reaction using the Human Signal Transduction Pathway Finder system.

Results. The expression of the main PI3K-AKT and NF-κB signaling pathways did not change in RPMI8226 / btz-6 subline cells. However, AKT kinase expression was significantly increased and PTEN protein expression was reduced in K562 / i-S9vlc cells with Pgp-overexpression. Significant changes in gene expression (42 %) were found in RPMI8226 / btz-6 cells related to a number of main signaling pathways in the tumor cell, namely: activation of 3–4 genes in signaling pathways related to hypoxia, oxidative stress, PPAR and p53. The highest activation in these cells was found in the TGFβ signaling pathway. In resistant K562 / i-S9vlc cells, expression of only 5 genes (10 %) increased: Fas, HMOX1, CPT2, ICAM, and SOCS3. Three genes were also identified that changed in both resistant sublines: Fas, HMOX1 and CPT2. Further, we showed that in the RPMI8226 / btz-6 subline, along with changes in the expression of signal transduction genes, there is a large pool of CD138-negative cells, and in the K562 / i-S9vlc subline, the number of cells expressing CD34 increases and the number of CD13 decreases.

Conclusion. We found that different signaling pathways are involved in the formation of resistance to bortezomib in the absence of Pgp expression and its overexpression. In addition, a cell line without activated resistance pathways requires more extensive rearrangements in the signal system to acquire resistance to bortezomib. However, in both cases, bortezomib leads to a change in the immunophenotype of the cells – to the appearance of dedifferentiated subpopulations.

Цель исследования – изучить влияние предсуществующей лекарственной устойчивости по механизму активации АВС-транспортеров – гиперэкспрессии Р-гликопротеина (Pgp) – на пути развития резистентности к протеасомному ингибитору бортезомибу.

Материалы и методы. В качестве моделей использовали культуры RPMI8226 и K562 / i-S9 (с гиперэкспрессией Pgp) и их резистентные к бортезомибу сублинии RPMI8226 / btz-6 и K562 / i-S9vlc. Применяли методы МТТ-теста, проточной цитометрии, вестерн-блоттинга и полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием системы Human Signal Transduction Pathway Finder.

Результаты. В клетках сублинии RPMI8226 / btz-6 не изменялась экспрессия основных белков PI3K-AKT и NF-κB-сигнальных путей. Однако в клетках сублинии K562 / i-S9vlc с гиперэкспрессией Pgp значительно повышалась экспрессия AKT-киназы и снижалась экспрессия белка PTEN. В клетках сублинии RPMI8226 / btz-6 были найдены значительные изменения в экспрессии генов (42 %), относящихся к ряду основных сигнальных путей в опухолевой клетке, а именно активация 3–4 генов в сигнальных путях, отно сящихся к гипоксии, оксидативному стрессу, PPAR и p53. Наибольшая активация в этих клетках обнаружена в TGFβ-сигнальном пути. В устойчивых клетках K562 / i-S9vlc усилилась экспрессия только 5 генов (10 %): Fas, HMOX1, CPT2, ICAM и SOCS3. Также были выделены 3 гена, экспрессия которых изменилась в обеих устойчивых сублиниях: Fas, HMOX1 и CPT2. Далее мы показали, что в сублинии RPMI8226 / btz-6, наряду с изменениями экспрессии генов сигнальной трансдукции, присутствует большой пул CD138-негативных клеток, а в сублинии K562 / i-S9vlc повышается количество клеток, экспрессирующих СD34, и снижается количество CD13.

Заключение. Мы выявили, что в формировании устойчивости к бортезомибу в клетках с отсутствием экспрессии Pgp и в клетках с гиперэкспрессией этого белка задействованы разные сигнальные пути. Кроме этого, клеточной линии без активированных путей устойчивости необходимы более масштабные перестройки в сигнальной системе для приобретения резистентности к бортезомибу. Однако и в том и в другом случае бортезомиб приводит к изменению иммунофенотипа клеток – к появлению дедифференцированных субпопуляций.

bortezomibmultiple myelomaP-glycoproteinsignal pathwaysAKTPTENNF-κBTGFβimmunophenotypeCD138CD34бортезомибмножественная миеломаР-гликопротеинсигнальные путиAKTPTENNF-κBTGFβиммунофенотипCD138CD34The study was performed with the support of the Russian Foundation for Basic Research (grant мол_а No. 18-315-00075).Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант мол_а №18-315-00075).Stavrovskaya A.A., Stromskaya T.P. Transporters of ABC protein superfamily and multidrug resistance of tumor cells. Biokhimiya = Bioche mistry 2008;73(5):735–50. (In Russ.).Ставровская А.А., Стромская Т.П. Транспортные белки семейства АВС и множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток. Биохимия 2008;73(5):735–50.Robak P., Drozdz I., Szemraj J. et al. Drug resistance in multiple myeloma. Cancer Treat Rev 2018;70;199–208. DOI: 10.1016/J.CTRV.2018.09.001.Muz B., Kusdono H.D., Azab F. et al. Tariquidar sensitizes multiple myeloma cells to proteasome inhibitors via reduction of hypoxia-induced P-gp-mediated drug resistance. Leuk Lymphoma 2017;58(12):2916–25. DOI: 10.1080/10428194.2017.1319052.Besse A., Stolze S.C., Rasche L. et al. Carfilzomib resistance due to ABCB1/ MDR1 overexpression is overcome by nelfinavir and lopinavir in multiple myeloma. Leukemia 2018;32(2):391–401. DOI: 10.1038/leu.2017.212.McCubrey J.A., Steelman L.S., Abrams S.L. et al. Roles of the RAF/ MEK/ERK and PI3K/PTEN/AKT pathways in malignant transformation and drug resistance. Adv Enzyme Regul 2006;46:249–79. DOI: 10.1016/j.advenzreg.2006.01.004.Traenckner E.B., Wilk S., Baeuerle P.A. A proteasome inhibitor prevents activation of NF-kappa B and stabilizes a newly phosphorylated form of I kappa B-alpha that is still bound to NF-kappa B. EMBO J 1994;13(22):5433–41.Karin M., Ben-Neriah Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol 2000;18:621–63. DOI: 10.1146/annurev.immunol.18.1.621.Akl M.R., Nagpal P., Ayoub N.M. et al. Molecular and clinical profiles of syndecan-1 in solid and hematological cancer for prognosis and precision medicine. Oncotarget 2015;6(30):28693–715. DOI: 10.18632/oncotarget.4981.Laletina L.A., Moiseeva N.I., Klimova D.A., Stavrovskaya A.A. The role of АВС transporters in drug resistance to bortezomib in multiple myeloma. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2019;6(1):49–55. (In Russ.). DOI: 10.17650/2313-805X-2019-6-1-49-56.Лалетина Л.А., Моисеева Н.И., Климова Д.А., Ставровская А.А. Роль АВС-транспортеров в формировании лекарственной устойчивости к бортезомибу при множественной миеломе. Успехи молекулярной онкологии 2019;6(1):49–55. DOI: 10.17650/2313-805X-2019-6-1-49-56.Панищева Л.А., Какпакова Е.С., Рыбалкина Е.Ю., Ставровская А.А. Влияние протеасомного ингибитора бортезомиба на экспрессию генов множественной лекарственной устойчивости и активность киназы. Биохимия 2011;76(9):1238–47.Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein-dye binding. Anal Biochem 1976;72(2):248–54. DOI: 10.1006/abio.1976.9999.Копнин Б.П. Энциклопедия клинической онкологии. M.: РЛС-Пресс, 2004. C. 34–53.Щербакова Е.А., Стромская Т.П., Рыбалкина Е.Ю., Ставровская A.A. Влияние повышения активности гена/ белка опухолевого супрессора PTEN на чувствительность малигнизированных клеток к химиотерапевтическим препаратам. Биологические мембраны 2007;24:143–50.Fujita T., Doihara H., Washio K. et al. Proteasome inhibitor bortezomib increases PTEN expression and enhances trastuzumab-induced growth inhibition in trastuzumab-resistant cells. Anticancer Drugs 2006;17(4): 455–62. DOI: 10.1097/01.cad.0000198910.90819.06.Hideshima T., Ikeda H., Chauhan D. et al. Bortezomib induces canonical nuclear factor-kappaB activation in multiple myeloma cells. Blood 2009;114(5):1046–52. DOI: 10.1182/blood-2009-01-199604.Matsumoto T., Abe M. TGF-β-related mechanisms of bone destruction in multiple myeloma. Bone 2011;48(1):129–34. DOI: 10.1016/j.bone.2010.05.036.Frassanito M., De Veirman K., Desantis V. et al. Halting pro-survival autophagy by TGFβ inhibition in bone marrow fibroblasts overcomes bortezomib resistance in multiple myeloma patients. Leukemia 2016;30:640–8. DOI: 10.1038/leu.2015.289.Frassanito M., De Veirman K., Desantis V. et al. Halting pro-survival autophagy by TGFβ inhibition in bone marrow fibroblasts overcomes bortezomib resistance in multiple myeloma patients. Leukemia 2016;30:640–8. DOI: 10.1038/leu.2015.289.Nakagawa Y., Ashihara E., Yao H. Multiple myeloma cells adapted to long-exposure of hypoxia exhibit stem cell characters with TGF-β/Smad pathway activation. Biochem Biophys Res Commun 2018;496(2):490–6. DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.01.034.Matsui W., Wang Q., Barber J.P. et al. Clonogenic multiple myeloma progenitors, stem cell properties, and drug resistance. Cancer Res 2008;68(1):190–7. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-07-3096.Matsui W., Huff C.A., Wang Q. et al. Characterization of clonogenic multiple myeloma cells. Blood 2004;103(6):2332–6. DOI: 10.1182/blood-2003-09-3064.Palumbo A., Avet-Loiseau H., Oliva S. et al. Revised international staging system for multiple myeloma: a report from International Myeloma Working Group. J Clin Oncol 2015;33(26):2863–9. DOI: 10.1200/JCO.2015.61.2267.Reghunathan R., Bi C., Liu S.C. et al. Clonogenic multiple myeloma cells have shared stemness signature associated with patient survival. Oncotarget 2013;4(8):1230–40. DOI: 10.18632/oncotarget.1145.Ramania V.C., Sanderson R.D. Chemotherapy stimulates syndecan-1 shedding: a potentially negative effect of treatment that may promote tumor relapse. Matrix Biol 2014;35:215–22. DOI: 10.1016/j.matbio.2013.10.005.Bandari S.K., Purushothaman A., Ramani V.C. et al. Chemotherapy induces secretion of exosomes loaded with heparanase that degrades extracellular matrix and impacts tumor and host cell behavior. Matrix Biol 2018;(65):104–18. DOI: 10.1016/j.matbio.2017.09.001.Inoue T., Swain A., Nakanishi Y., Sugiyama D. Multicolor analysis of cell surface marker of human. Anticancer Res 2014;34(8):4539–50.Kamano H., Ohnishi H., Tanaka T. et al. Effects of the antisense v-myb’ expression on K562 human leukemia cell proliferation and differentiation. Leuk Res 1990;14(10):831–9. DOI: 10.1016/0145-2126(90)90171-5.