Introduction. Human papillomavirus (HPV) infection with high-risk HPVs is an etiological factor in the development of cervical cancer, with HPV type 16 (HPV16) being the most common. The mechanisms leading to disruption of viral oncogene expression and initiation of epithelial cell transformation are poorly understood. Epigenetic regulatory factors, including cellular miRNAs, may play an important role in HPV-induced carcinogenesis, and aberrantly expressed miRNAs may be promising markers for the diagnosis of HPV-associated lesions.Aim. To search for miRNAs involved in the pathogenesis of HPV16-associated cervical cancer and to evaluate their diagnostic potential for the detection of cervical cancer and precancerous lesions.Materials and methods. MiRNA expression in clinical samples was assessed by both next generation sequencing and quantitative stem-loop polymerase chain reaction (sl-qPCR). Plasma miRNAs from patients with precancerous and cancerous lesions and healthy donors were analyzed using sl-qPCR. Loss of heterozygosity in cervical cancer samples was assessed by copy number ratio of MIR135A1 and ACTB genes. A total of 67 patients with cervical cancer, 21 with precancerous cervical lesions and 24 healthy donors were included in the study. The effect of DNA methylation on miRNA-135A1 expression was evaluated after treatment with a demethylating agent of the cervical HPV16-positive SiHa cell line. Changes in the expression of the HPV16 E6 oncogene were analyzed after transfection with synthetic analogues of the mature forms of miRNA-135А1 (miRNA-135a-3p and miRNA-135a-5p).Results. A significant decrease in the expression of miRNA-135A1 and miRNA-135A2 was detected in tumor tissue samples from HPV16-positive cervical cancer, which was confirmed by sl-qPCR in an independent panel of tumor samples. A decrease in miRNA-135A1 expression was shown to result from both loss of heterozygosity of the gene and aberrant DNA methylation. Transfection of mature forms of miRNA-135A1 into SiHa cells resulted in decreased expression of the E6 oncogene of HPV16. Blood plasma samples from patients with cervical cancer and precancerous lesions showed lower levels of miRNA-135a-3p than healthy donors, and ROC analysis indicated its high diagnostic potential.Conclusion. Levels of miRNA-135A1 are significantly reduced in cervical lesions, both in tumor tissue and plasma, and the ability of this miRNA to suppress the expression of the HPV16 E6 oncogene suggests its oncosuppressive properties. Thus, miRNA-135A1 can be used as a promising new marker for the diagnosis of HPV-associated lesions.
Введение. Инфекция вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого онкогенного риска является этиологическим фактором развития рака шейки матки, причем наиболее распространенным является ВПЧ 16-го типа (ВПЧ16). Механизмы, приводящие к нарушению экспрессии вирусных онкогенов и запуску процесса онкотрансформации, недостаточно изучены. Эпигенетические факторы регуляции, в том числе клеточные микроРНК, могут играть большую роль в ВПЧ-индуцированном канцерогенезе, а аберрантно экспрессированные микроРНК рассматриваться как перспективные маркеры для диагностики ВПЧ-ассоциированных поражений.Цель исследования – поиск микроРНК, вовлеченных в патогенез ВПЧ16-ассоциированного рака шейки матки, и оценка их диагностического потенциала для выявления рака или предраковых поражений шейки матки.Материалы и методы. Экспрессию микроРНК в клинических образцах оценивали с помощью секвенирования нового поколения (next generation sequencing, NGS) и количественной stem-loop полимеразной цепной реакции (sl-кПЦР), для анализа микроРНК в плазме крови использовали sl-кПЦР. Потерю гетерозиготности в образцах рака шейки матки оценивали по соотношению числа копий генов MIR135A1 и ACTB. Всего в исследование вошли 67 пациентов с раком шейки матки, 21 с предраковыми поражениями шейки матки и 24 здоровых донора. Влияние метилирования ДНК на экспрессию микроРНК-135A1 оценивали после обработки деметилирующим агентом цервикальной ВПЧ16-положительной клеточной линии SiHa. Изменение экспрессии онкогена E6 ВПЧ16 оценивали после трансфекции синтетических аналогов зрелых форм микроРНК-135a-3p и микроРНК-135a-5p.Результаты. В образцах опухолевой ткани ВПЧ16-положительного рака шейки матки выявлено значительное снижение экспрессии микроРНК-135А1 и микроРНК-135A2, что подтверждено на независимой выборке опухолевого материала методом sl-кПЦР. Снижение экспрессии микроРНК-135A1 может быть обусловлено как потерей гетерозиготности соответствующего гена, так и аберрантным метилированием ДНК. Трансфекция зрелых форм микроРНК в клетки SiHa приводила к снижению экспрессии онкогена E6 ВПЧ16. В образцах плазмы крови пациентов с РШМ и предраковыми поражениями наблюдается более низкий уровень микроРНК-135a-3p, чем у здоровых доноров, а проведенный ROC-анализ указывает на ее высокую диагностическую значимость.Заключение. Уровень микроРНК-135А1 значительно снижен при цервикальных поражениях как в опухолевой ткани, так и в плазме крови, а способность данной микроРНК подавлять экспрессию онкогена E6 ВПЧ16 говорит о наличии у нее онкосупрессорных свойств. Таким образом, микроРНК-135А1 является перспективным маркером для диагностики ВПЧ-ассоциированных поражений.