Advances in Molecular OncologyAdvances in Molecular OncologyУспехи молекулярной онкологии2313-805X2413-3787Publishing House ABV Press73410.17650/2313-805X-2024-11-4-114-126RESEARCH ARTICLESЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИDevelopment of an in vitro model to study the role of disulfide bonds in the largest extracellular domain of the sodium-dependent phosphate transporter NaPi2b in OVCAR-8 ovarian carcinoma cellsСоздание in vitro модели для изучения роли дисульфидных связей в составе большого внеклеточного домена натрий-зависимого фосфатного транспортера NaPi2b в клетках карциномы яичника OVCAR-8https://orcid.org/0000-0002-6342-0390SkripovaV. S.СкриповаВ. С.
Russian Federation

Vera Sergeevna Skripova

Bld. 1, 18 Kremlevskaya St., Kazan 420008

Вера Сергеевна Скрипова

420008 Казань, ул. Кремлевская, 18, корп. 1

v.s.skripova@yandex.ruhttps://orcid.org/0009-0007-5744-1615FirsovaD. A.ФирсоваД. А.
Russian Federation

Bld. 1, 18 Kremlevskaya St., Kazan 420008

420008 Казань, ул. Кремлевская, 18, корп. 1

https://orcid.org/0009-0007-2262-4200KilunovA. V.КилуновА. В.
Russian Federation

Bld. 1, 18 Kremlevskaya St., Kazan 420008

420008 Казань, ул. Кремлевская, 18, корп. 1

https://orcid.org/0000-0001-6696-8477BulatovaL. F.БулатоваЛ. Ф.
Russian Federation

Bld. 1, 18 Kremlevskaya St., Kazan 420008

420008 Казань, ул. Кремлевская, 18, корп. 1

https://orcid.org/0009-0008-0426-3621PoputskyM. A.ПопутскийМ. А.
Russian Federation

Bld. 1, 18 Kremlevskaya St., Kazan 420008

420008 Казань, ул. Кремлевская, 18, корп. 1

https://orcid.org/0000-0002-2547-2843KiyamovaR. G.КиямоваР. Г.
Russian Federation

Ramziya Gallyamovna Kiyamova

Bld. 1, 18 Kremlevskaya St., Kazan 420008

Рамзия Галлямовна Киямова

420008 Казань, ул. Кремлевская, 18, корп. 1

kiyamova@mail.ruResearch Laboratory “Biomarker”, Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan (Volga Region) Federal UniversityНаучно-исследовательская лаборатория «Биомаркер», Институт фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»151220241141141261012202410122024Copyright ©; 2024, Skripova V.S., Firsova D.A., Kilunov A.V., Bulatova L.F., Poputsky M.A., Kiyamova R.G.Copyright ©; 2024, Скрипова В.С., Фирсова Д.А., Килунов А.В., Булатова Л.Ф., Попутский М.А., Киямова Р.Г.2024Skripova V.S., Firsova D.A., Kilunov A.V., Bulatova L.F., Poputsky M.A., Kiyamova R.G.Скрипова В.С., Фирсова Д.А., Килунов А.В., Булатова Л.Ф., Попутский М.А., Киямова Р.Г.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://umo.abvpress.ru/jour/article/view/734

Introduction. The sodium-dependent phosphate transporter NaPi2b is a promising target for targeted antitumor therapy. There is the largest extracellular domain (ECD) containing a cryptic MX35 epitope, against which therapeutic antibodies have been developed and are undergoing preclinical and clinical trials. The accessibility of the MX35 epitope to antibodies is higher in tumor cells and depends on the conformation of the ECD, determined by disulfide bonds between cysteine residues C303, C322, C328 and C350. The number of these disulfide bonds and cysteine residues that participate in the NaPi2b ECD conformation maintaining, regulation of its transport activity and stability is unknown. Isolation and purification of transmembrane proteins, including NaPi2b, for structural and functional studies is difficult, therefore it is necessary to develop an in vitro model to study the formation of disulfide bonds in the ECD region of the NaPi2b transporter and their role in ensuring the availability of the cryptic MX35 epitope and transporter activity in living cells.Aim. To create a panel of clonal sublines of human ovarian carcinoma OVCAR-8 containing recombinant variants of the wild-type NaPi2b transporter, as well as with single and double substitutions of cysteine residues in the ECD region with alanine residues.Materials and methods. OVCAR-8 ovarian carcinoma cells that do not express the NaPi2b transporter gene were transduced with lentiviral particles carrying nucleotide sequences encoding the wild-type NaPi2b transporter or its mutant variants with single and double substitutions of cysteine residues C303, C322, C328 and C350 with alanine residues to simulate reduction of potential disulfide bonds between them. After selecting transduced cells, clonal sublines were obtained, in the lysates of which the content of recombinant variants of the NaPi2b transporter was assessed using Western blot analysis and dot blot analysis.Results. A panel of 9 clonal sublines of OVCAR-8 ovarian carcinoma containing the wild-type recombinant NaPi2b transporter and its mutant variants was obtained. The effect of the introduced amino acid substitutions on the content and electrophoretic mobility of the NaPi2b transporter was noted.Conclusion. The resulting panel of clonal sublines can be used as an in vitro model to study the conformation of the ECD transporter NaPi2b, determined by disulfide bonds, which will reveal the mechanism of formation of the cryptic MX35 epitope and shed light on the role of ECD in the regulation of NaPi2b transport activity. Understanding the mechanism of formation of the cryptic MX35 epitope will make it possible to find new cryptic epitopes in the extracellular domains of transmembrane proteins, which can be used as targets for antitumor therapy.

Введение. Натрий-зависимый фосфатный транспортер NaPi2b – перспективная мишень для таргетной противоопухолевой терапии. его большой внеклеточный домен (ВКД) содержит скрытый эпитоп MX35, против которого разработаны терапевтические антитела, проходящие доклинические и клинические испытания. Доступность эпитопа MX35 для антител выше в опухолевых клетках и зависит от конформации ВКД, обусловленной дисульфидными связями между остатками цистеина С303, С322, С328 и С350. количество этих дисульфидных связей неизвестно, как и то, какие именно остатки цистеина участвуют в поддержании конформации ВКД NaPi2b, возможной регуляции его транспортной активности и стабильности. Выделение и очистка трансмембранных белков, включая NaPi2b, для структурных и функциональных исследований являются трудно разрешимыми задачами, поэтому необходимо разработать in vitro модель для изучения особенностей формирования дисульфидных связей в области ВКД транспортера NaPi2b, а также определения их роли в обеспечении доступности скрытого эпитопа MX35 и активности транспортера в живых клетках.Цель исследования – создание панели клональных сублиний карциномы яичника человека OVCAR-8, содержащих рекомбинантные варианты транспортера NaPi2b дикого типа, а также варианты с одиночными и двойными заменами остатков цистеина в области ВКД на остатки аланина.Материалы и методы. Клетки карциномы яичника OVCAR-8, не экспрессирующие ген транспортера NaPi2b, трансдуцировали лентивирусными частицами, несущими нуклеотидные последовательности, кодирующие транспортер NaPi2b дикого типа или его мутантные варианты с одиночными и двойными заменами остатков цистеина С303, С322, С328 и С350 на остатки аланина, для имитации восстановления потенциальных дисульфидных связей между ними. после отбора трансдуцированных клеток получали клональные сублинии, в лизатах которых методами вестерн- и дот-блоттинга оценивали содержание рекомбинантных вариантов транспортера NaPi2b. Результаты. Получена панель из 9 клональных сублиний карциномы яичника OVCAR-8, содержащих рекомбинантный транспортер NaPi2b дикого типа и его мутантные варианты. Отмечено влияние введенных аминокислотных замен на содержание и электрофоретическую подвижность транспортера NaPi2b. Заключение. Полученная панель клональных сублиний может быть использована в качестве in vitro модели для изучения конформации ВКД транспортера NaPi2b, обусловленной дисульфидными связями, что позволит раскрыть механизм образования скрытого эпитопа MX35 и пролить свет на роль ВКД в регуляции транспортной активности NaPi2b. понимание механизма образования скрытого эпитопа MX35 даст возможность найти новые скрытые эпитопы в составе внеклеточных доменов трансмембранных белков, которые могут быть использованы в качестве мишеней для таргетной противоопухолевой терапии.

NaPi2bSLC34A2malignancydisulfid bondtumor-specific epitopeconformationNaPi2bSLC34A2злокачественное новообразованиедисульфидная связьопухоль-специфический эпитопконформацияThe study was carried out with infrastructure support of the Kazan Federal University Strategic Academic Leadership Program (Priority-2030). The work was supported by the Russian Science Foundation grant (grant No. 23-15-00456, https://rscf.ru/project/23-15-00456/).Исследование выполнено при инфраструктурной поддержке Программы стратегического академического лидерства Казанского (Приволжского) федерального университета («Приоритет-2030»). Работа выполнена за счет гранта Российского научного фонда (грант № 23-15-00456, https://rscf.ru/project/23-15-00456/).Forster I.C. The molecular mechanism of SLC34 proteins: insights from two decades of transport assays and structure-function studies. Pflugers Arch European J Physiology 2019;471:15–42. DOI: 10.1007/s00424-018-2207-zMurer H., Forster I., Biber J. The sodium phosphate cotransporter family SLC34. Pflugers Arch 2004;447:763–7. DOI: 10.1007/s00424-003-1072-5Homann V., Rosin-Steiner S., Stratmann T. et al. Sodium-phosphate cotransporter in human salivary glands: molecular evidence for the involvement of NPT2b in acinar phosphate secretion and ductal phosphate reabsorption. Arch Oral Biol 2005;50(9):759–68. DOI: 10.1016/j.archoralbio.2005.01.009Nishimura M., Naito S. Tissue-specific mRNA expression profiles of human solute carrier transporter superfamilies. Drug Metab Pharmacokinet 2008;23(1):22–44. DOI: 10.2133/dmpk.23.22Kiyamova R., Shyian M., Lyzogubov V.V. et al. Immunohistochemical analysis of NaPi2b protein (MX35 antigen) expression and subcellular localization in human normal and cancer tissues. Exp Oncol 2011;33(3):157–61.Rangel L.B.A., Sherman-Baust C.A., Wernyj R.P. et al. Characterization of novel human ovarian cancer-specific transcripts (HOSTs) identified by serial analysis of gene expression. Oncogene 2003;22(46):7225–32. DOI: 10.1038/sj.onc.1207008Kopantzev E.P., Monastyrskaya G.S., Vinogradova T.V. et al. Differences in gene expression levels between early and later stages of human lung development are opposite to those between normal lung tissue and non-small lung cell carcinoma. Lung Cancer 2008;62(1):23–34. DOI: 10.1016/j.lungcan.2008.02.011Gryshkova V., Goncharuk I., Gurtovyy V. et al. The study of phosphate transporter NAPI2B expression in different histological types of epithelial ovarian cancer. Exp Oncol 2009;31(1):37–42.Chen D.R., Chien S.Y., Kuo S.J. et al. SLC34A2 as a novel marker for diagnosis and targeted therapy of breast cancer. Anticancer Res 2010;30(10):4135–40.Kim H.S., Kim D.H., Kim J.Y. et al. Microarray analysis of papillary thyroid cancers in korean. Korean J Intern Medicine 2010;25(4):399–407. DOI: 10.3904/kjim.2010.25.4.399Shyian M., Gryshkova V., Kostianets O. et al. Quantitative analysis of SLC34A2 expression in different types of ovarian tumors. Exp Oncol 2011;33(2):94–8.Soares I.C., Simões K., de Souza J.E. et al. In Silico analysis and immunohistochemical characterization of NaPi2b protein expression in ovarian carcinoma with monoclonal antibody Mx35. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2012;20(2):165–72. DOI: 10.1097/pai.0b013e318228e232Zhang Z., Ye S., Zhang M. et al. High expression of SLC34A2 is a favorable prognostic marker in lung adenocarcinoma patients. Tumor Biol 2017;39(7):1010428317720212. DOI: 10.1177/1010428317720212Mattes M.J., Look K., Furukawa K. et al. Mouse monoclonal antibodies to human epithelial differentiation antigens expressed on the surface of ovarian carcinoma ascites cells. Cancer Res 1987;47(24 Pt 1):6741–50.Yin B.W.T., Kiyamova R., Chua R. et al. Monoclonal antibody MX35 detects the membrane transporter NaPi2b (SLC34A2) in human carcinomas. Cancer Immun 2008;8:3.Kiyamova R.G., Gryshkova V.S., Usenko V.S. et al. Identification of phosphate transporter Napi2b as MX35 cancer antigen by modified SEREX approach. Biopolym Cell 2008;24(3):218–24. DOI: 10.7124/bc.0007A3Kiyamova R., Gryshkova V., Ovcharenko G. et al. Development of monoclonal antibodies specific for the human sodium-dependent phosphate co-transporter NaPi2b. Hybridoma 2008;27(4):277–84. DOI: 10.1089/hyb.2008.0015Dos Santos M.L., Yeda F.P., Tsuruta L.R. et al. Rebmab200, a humanized monoclonal antibody targeting the sodium phosphate transporter NaPi2b displays strong immune mediated cytotoxicity against cancer: a novel reagent for targeted antibody therapy of cancer. PloS One 2013;8(7):e70332. DOI: 10.1371/journal.pone.0070332Fessler S., Dirksen A., Collins S.D. et al. XMT-1592, a site-specific dolasynthen-based NaPi2b-targeted antibody-drug conjugate for the treatment of ovarian cancer and lung adenocarcinoma. Cancer Res 2020;80(16_Suppl.):2894. DOI: 10.1158/1538-7445.am2020-2894Bodyak N.D., Mosher R., Yurkovetskiy A.V. et al. the dolaflexin-based antibody-drug conjugate XMT-1536 targets the solid tumor lineage antigen SLC34A2/NaPi2b. Mol Cancer Ther 2021;20(5):896–905. DOI: 10.1158/1535-7163.mct-20-0183Kostianets O., Shyian M., Sergiy D. et al. Serological analysis of SEREX-defined medullary breast carcinoma-associated antigens. Cancer Invest 2012;30(7):519–27. DOI: 10.3109/07357907.2012.697231Garifulin O.M., Kykot V.O., Gridina N.Y. et al. Application of SEREX-analysis for identification of human colon cancer antigens. Exp Oncol 2015;37(3):173–80. DOI: 10.31768/2312-8852.2015.37(3):173-180Kostianets O., Shyyan M., Antoniuk S.V. et al. Panel of SEREX-defined antigens for breast cancer autoantibodies profile detection. Biomarkers 2017;22(2):149–56. DOI: 10.1080/1354750X.2016.1252952Rubin S.C., Kostakoglu L., Divgi C. et al. Biodistribution and intraoperative evaluation of radiolabeled monoclonal antibody Mx35 in patients with epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol 1993;51(1):61–6. DOI: 10.1006/gyno.1993.1247Lindegren S., Andrade L.N.S., Bäck T. et al. Binding affinity, specificity and comparative biodistribution of the parental murine monoclonal antibody MX35 (Anti-NaPi2b) and its humanized version Rebmab200. PloS One 2015;10(5):e0126298. DOI: 10.1371/journal.pone.0126298Korotaeva A.V., Bulatova L.F., Vlasenkova R.A., Kiyamova R.G. Recognition of the Na-dependent phosphate transporter NaPi2b by monoclonal antibodies in bacterial and eukaryotic cells. Biotekhnologia = Biotechnology 2022;38(5):66–72. (In Russ.). DOI: 10.56304/S023427582205009XКоротаева А.В., Булатова Л.Ф., Власенкова Р.А., Киямова Р.Г. Распознавание Na-зависимого фосфатного транспортера NaPi2b моноклональными антителами в клетках бактерий и эукариот. Биотехнология 2022;38(5):66–72. DOI: 10.56304/S023427582205009XKiyamova R., Minigulova L.F., Skripova V. et al. N-glycosylation status of membrane phosphate transporter NaPi2b is crucial for its epitope recognition by monoclonal antibody in tumour cells. Annals of Oncology 2020;31(Suppl. 5):S1227–8. DOI: 10.1016/j.annonc.2020.08.2193Bulatova L.F., Skripova V.S., Korotaeva A.V. et al. Recognition of mutant forms of the sodium-dependent phosphate transporter NaPi2b by monoclonal antibodies in ovarian cancer cells. Kazanskij meditsinskiy zhurnal = Kazan Medical Journal 2022;103(4):608–16. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.17816/KMJ2022-608Булатова Л.Ф., Скрипова В.С., Коротаева А.В. и др. Распознавание мутантных форм натрий-зависимого фосфатного транспортера NaPi2b моноклональными антителами в клетках рака яичника. Казанский медицинский журнал 2022;103(4):608–16. DOI: https://doi.org/10.17816/KMJ2022-608Reshetnikova D., Bulatova L.F., Skripova V. et al. Effect of disulfide bonds and N-glycosylation on the recognition of the NaPi2b transporter by monoclonal antibodies. Annals of Oncology 2022;33(Suppl. 8):S1408. DOI: 10.1016/j.annonc.2022.09.082Minigulova L.F., Skripova V.S., Nurgalieva A.K. Recognition of the sodium-dependent phosphate transporter NaPi2b by monoclonal antibodies N-NaPi2b in ovarian cancer cells. Uchenye zapiski Kazanskogo universiteta = Scientific Notes of Kazan University 2020;162(4):529–40 (In Russ.). DOI: 10.26907/2542-064X.2020.4.529-540Минигулова Л.Ф., Скрипова В.С., Нургалиева А.К. и др. Распознавание натрий-зависимого фосфатного транспортера NaPi2b моноклональными антителами N-NaPi2b в клетках карциномы яичника. Ученые записки Казанского университета 2020;162(4):529–40. DOI: 10.26907/2542-064X.2020.4.529-540Firsova D., Levashov I., Reshetnikova D. et al. Analysis of the sodium-dependent phosphate transporter NaPi2b expression in human tumor cell lines. EJCI 2022;52(S1):114–5. DOI: https://doi.org/10.1111/eci.13796Bulatova L.F., Skripova V.S., Nurgalieva A.K. et al. Structurally constrained tumor-specific epitope within the largest extracellular domain of sodium-dependent phosphate transporter NaPi2b. Ann Oncol 2021;32(5):S368–9. DOI: 10.1016/j.annonc.2021.08.304Makhov P., Golovine K., Teper E. et al. Piperlongumine promotes autophagy via inhibition of Akt/mTOR signalling and mediates cancer cell death. Br J Cancer 2014;110(4):899–907. DOI: 10.1038/bjc.2013.810Longo P.A., Kavran J.M., Kim M.S., Leahy D.J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enzymol 2013;529:227–40. DOI: 10.1016/B978-0-12-418687-3.00018-5Boichuk S., Dunaev P., Skripova V. et al. Unraveling the mechanisms of sensitivity to anti-FGF therapies in imatinib-resistant gastrointestinal stromal tumors (GIST) lacking secondary KIT mutations. Cancers (Basel) 2023;15(22):5354. DOI: 10.3390/cancers15225354Zavodszky M., Chen C.W., Huang J.K. et al. Disulfide bond effects on protein stability: designed variants of Cucurbita maxima trypsin inhibitor-V. Protein Sci 2001;10(1):149–60. DOI: 10.1110/ps.26801Karimi M., Ignasiak M.T., Chan B. et al. Reactivity of disulfide bonds is markedly affected by structure and environment: implications for protein modification and stability. Sci Rep 2016;6:38572. DOI: 10.1038/srep38572Feige M.J., Braakman I., Hendershot L.M. Basic principles, cellular regulation and engineering. In: Oxidative folding of proteins. Ed. by M.J. Feige. The Royal Society of Chemistry, 2018. Pp. 1–33.Bakshi T., Pham D., Kaur R., Sun B. Hidden relationships between N-glycosylation and disulfide bonds in individual proteins. Int J Mol Sci 2022;23(7):3742. DOI: 10.3390/ijms23073742