Introduction. One of the key components of cell membranes are membrane proteins, which provide a wide range of functions – from transport and signal transmission to coordination of intercellular interactions. Among them, of particular interest is the sodium-dependent phosphate transporter NaPi2b, which plays an important role in maintaining phosphate homeostasis and is characterized by an increased content in a number of tumor cells. The large extracellular domain (ECD) of NaPi2b contains the MX35 epitope, which is of significant interest in the context of the development of monoclonal antibodies for targeted therapy of ovarian and lung carcinoma. Recognition of the MX35 epitope depends on the conformation of the large ECD, which is influenced by disulfide bonds and glycosylation. Between cysteine residues C322 and C328, there is a proline residue P325, which we hypothesize may contribute to the conformation of the NaPi2b large ECD by forming a disulfide bond between C322 and C328, potentially affecting the interaction of monoclonal antibodies with the MX35 epitope.
Aim. To study the impact of the proline residue at position 325 in the large ECD of the transporter NaPi2b on the interaction of monoclonal antibodies L3(28/1) with the MX35 epitope.
Materials and methods. The human ovarian epithelial carcinoma cell lines OVCAR-8 and OVCAR-4 were used in the study. By site-directed mutagenesis, the proline residue P325 of NaPi2b was replaced with an alanine residue, resulting in OVCAR-8 cells stably expressing the mutant variant of NaPi2bp.P325A. The effect of the p.P325A substitution in NaPi2b on the interaction of monoclonal antibodies L3(28/1) with the MX35 epitope was analyzed using western blotting and laser confocal microscopy. To assess the impact of the p.P325A mutation on the formation of disulfide bonds in the NaPi2b large ECD, cysteine residues thiol groups were modified using maleimide-containing compounds.
Results. It was found that the substitution of p.P325A in NaPi2b did not significantly affect the recognition of the MX35 epitope by L3(28/1) antibodies, as shown by both western blot analysis and confocal microscopy. The number of disulfide bonds in the large ECD of the mutant NaPi2bp.P325A form was unchanged compared to wild-type NaPi2b.
Conclusion. Substitution p.P325A in the NaPi2b transporter does not have a significant effect on the recognition of the MX35 epitope by antibodies or the formation of disulfide bonds in the NaPi2b large ECD. Future studies could focus on a more detailed investigation of the roles of other substitutions in the NaPi2b large ECD and their influence on the epitope’s accessibility to antibodies.
Введение. Одним из ключевых компонентов клеточных мембран являются мембранные белки, обеспечивающие широкий спектр функций – от транспорта и передачи сигналов до координации межклеточных взаимодействий. Среди них особый интерес представляет натрийзависимый фосфатный транспортер NaPi2b, играющий большую роль в поддержании гомеостаза фосфатов и содержащийся в большом количестве в ряде опухолевых клеток. В состав большого внеклеточного домена (ВКД) NaPi2b входит эпитоп MX35, который представляет значительный интерес в контексте разработки моноклональных антител для таргетной терапии карциномы яичника и легкого. Рас познавание эпитопа MX35 зависит от конформации большого ВкД, обусловленной дисульфидными связями и гликозилированием. Между двумя остатками цистеина – С322 и С328 – находится остаток пролина P325, который, как мы предполагаем, может участвовать в формировании конформации большого ВКД NaPi2b посредством образования дисульфидной связи С322–С328, влияющей на взаимодействие моноклональных антител и эпитопа MX35.
Цель исследования – изучение влияния остатка пролина в положении 325 в области большого ВКД транспортера NaPi2b на взаимодействие моноклональных антител L3(28/1) с эпитопом MX35.
Материалы и методы. В исследовании использованы клеточные линии эпителиальной карциномы яичника чело века OVCAR-8 и OVCAR-4. путем сайт-направленного мутагенеза остаток пролина P325 NaPi2b заменили на остаток аланина, в результате чего были получены клетки OVCAR-8, стабильно экспрессирующие мутантный вариант NaPi2bp.P325A. С помощью вестерн-блот-анализа и лазерной конфокальной микроскопии изучено влияние замены p.P325A NaPi2b на взаимодействие моноклональных антител L3(28/1) и эпитопа МХ35. Для определения влияния мутации p.P325A на формирование дисульфидных связей в большом ВКД NaPi2b проводили модификацию тиоловых групп остатков цистеина с использованием малеимидсодержащих соединений.
Результаты. Выявлено, что замена p.P325A NaPi2b не оказывает значительного влияния на распознавание эпитопа MX35 антителами L3(28/1) как при вестерн-блот-анализе, так и при конфокальной микроскопии. количество дисульфидных связей в большом ВКД NaPi2bp.P325A не менялось по сравнению с NaPi2b дикого типа.
Заключение. Замена p.P325A транспортера NaPi2b не оказывает значимого влияния на распознавание эпитопа MX35 антителами и формирование дисульфидных связей в большом ВКД NaPi2b. Дальнейшие исследования могут быть направлены на более детальное изучение роли других замен в большом ВКД NaPi2b и их влияния на доступность эпитопа для антител.