Laboratory of Molecular Oncobiology; Ufa Institute of Chemistry
Лаборатория молекулярной онкобиологии, Уфимский институт химии
Anti-cluster-of-differentiation (anti-CD) antibody microarray is an attractive multiplex analogue to leukocyte immunocytochemistry for surface markers. The transparent plastic microarray support permits to sort leukocytes by their surface lineage-specific markers making them available for subsequent high-resolution morphology examination. The combined data on the pathologic cells’ immunophenotype, morphology and cytochemistry from the microarray is sufficient to suggest preliminary diagnosis in many leukemia types. However, in some cases additional staining for internal markers is required, i.e. in T cell acute leukemia the T cell origin of the blasts can only be proved by the presence of cytoplasmic CD3 (cytCD3). Here we describe a new protocol of immunocytochemical detection of internal proteins in mononuclear cells captured by mouse anti-CD antibodies on the microarray surface. The protocol uses primary mouse FITC-conjugated (FITC – fluorescein isothiocyanate) antibodies against the target, secondary anti-FITC antibodies conjugated with alkaline phosphatase and colorimetric alkaline phosphatase substrate, BCIP/NBT. We show on normal leukocytes and leukemic cell lines that the protocol is sensitive and specific. The percentages of cytCD3-positive cells determined by this method in bone marrow aspirates of two patients with T cell acute lymphoblastic leukemia are in excellent agreement with flow cytometry results. This method expands the diagnostic capabilities of anti-CD antibody microarray.
Клеточный биочип – привлекательный аналог многоцветной иммуноцитохимии для определения поверхностных CD-антигенов лейкоцитов. Прозрачный пластиковый биочип позволяет сортировать лейкоциты по их поверхностным детерминантам для последующего морфологического исследования с высоким разрешением. Комбинации данных об иммунофенотипе, морфологических и цитохимических особенностях патологических клеток, полученных с помощью клеточного биочипа, достаточно для установления предварительного диагноза при многих типах лейкозов. Однако в некоторых случаях для этого необходимо определение цитоплазматических маркеров. Например, в случаях Т-клеточных лейкозов Т-клеточная природа бластов должна быть подтверждена наличием цитоплазматического CD3 (cytCD3).
В статье представлен новый протокол иммуноцитохимической детекции внутриклеточных белков в мононуклеарных клетках, связавшихся с мышиными anti-CD-антителами на клеточном биочипе. В нем использованы первичные мышиные FITC-конъюгированные (FITC – флуоресцеин изотиоцианат) антитела к цитоплазматическим белкам-мишеням, вторичные anti-FITC-антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой, и колометрический субстрат BCIP/NBT для щелочной фосфатазы. На лейкоцитах здоровых доноров и лейкозных клеточных линиях мы показали, что протокол является довольно чувствительным и специфичным. Процент cytCD3-положительных клеток, определенный описанным методом в аспиратах костного мозга 2 пациентов с Т-клеточным острым лимфобластным лейкозом, подтверждается результатами проточной цитометрии. Данный метод расширяет диагностические возможности клеточного биочипа.