Advances in Molecular OncologyAdvances in Molecular OncologyУспехи молекулярной онкологии2313-805X2413-3787Publishing House ABV Press8810.17650/2313-805X-2017-4-1-46-52RESEARCH ARTICLESЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИDetection of gene mutations in genome “hot” spots: “hairpin” amplicons in DNA melting analysisВыявление мутаций в «горячих» участках генома: ампликоны-«шпильки» в методе плавления ДНКKondratovaV. N.КондратоваВ. Н.
Russian Federation

24 Kashirskoye Shosse, Moscow 115478, Russia

Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24

BotezatuI. V.БотезатуИ. В.
Russian Federation

24 Kashirskoye Shosse, Moscow 115478, Russia

Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24

ShelepovV. P.ШелеповВ. П.
Russian Federation

24 Kashirskoye Shosse, Moscow 115478, Russia

Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24

LichtensteinA. V.ЛихтенштейнА. В.
Russian Federation

24 Kashirskoye Shosse, Moscow 115478, Russia

Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24

alicht@mail.ruResearch Institute of Carcinogenesis, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of RussiaНИИ канцерогенеза ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России150120174146521804201718042017Copyright ©; 2017, Kondratova V.N., Botezatu I.V., Shelepov V.P., Lichtenstein A.V.Copyright ©; 2017, Кондратова В.Н., Ботезату И.В., Шелепов В.П., Лихтенштейн А.В.2017Kondratova V.N., Botezatu I.V., Shelepov V.P., Lichtenstein A.V.Кондратова В.Н., Ботезату И.В., Шелепов В.П., Лихтенштейн А.В.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://umo.abvpress.ru/jour/article/view/88

Polymerase chain reaction (PCR) followed by DNA melting analysis with TaqMan probes effectively reveals mutations in the human genome “hot” spots. The necessity to carry out PCR in the asymmetric variant causes, however, a number of restrictions of this method: 1) an inability of quantitative estimates of gene copy numbers; 2) the need for 2 independent PCR tests for detection of mutations in both complementary strands of an amplicon (this approach improves reliability and sensitivity of the analysis); 3) the complication of PCR design and decrease in efficiency of amplification. Overcoming these restrictions was possible by means of symmetric PCR with primers containing the specific and universal sequences: the single-stranded “hairpins” (sense and antisense) are not capable to anneal with each other, but they can hybridize independently with 2 TaqMan probes present in the reaction mixture. The proposed approach allows quantitative and qualitative characterization of a DNA sample (the copy number estimates as well as mutation scanning of both complementary amplicon strands).

Амплификация с последующим плавлением ДНК с зондами TaqMan эффективно выявляет мутации в «горячих» участках генома. Однако необходимость проводить полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в асимметричном варианте обусловливает ряд ограничений этого метода: 1) невозможность количественного анализа из‑за снижения эффективности амплификации; 2) необходимость выполнения 2 независимых ПЦР для выявления мутаций в комплементарных нитях ампликона; 3) усложнение дизайна ПЦР. Преодоление этих ограничений оказалось возможным при использовании в симметричной ПЦР комбинированных праймеров, состоящих из универсальной и специфической последовательностей: образующиеся в результате однонитевые «шпилечные» (hairpin) ампликоны (sense и antisense) не способны ренатурировать друг с другом, но независимо гибридизуются с присутствующими в среде зондами TaqMan (antisense и sense соответственно). Разработанный способ позволяет в одном тесте получить количественные (число копий) и качественные (наличие мутаций в обеих нитях ампликона) характеристики исследуемого участка ДНК.

mutation scanningDNA melting analysisTaqMan probesKRAS“hairpin” ampliconsсканирование мутацийплавление ДНКзонды TaqManKRAS«шпилечные» ампликоны1. Prior I.A., Lewis P.D., Mattos C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Cancer Res 2012;72(10): 2457–67.Prior I.A., Lewis P.D., Mattos C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Cancer Res 2012;72(10): 2457–67.2. Yang W., Shelton D.N., Berman J.R. et al. Droplet digital™ PCR: multiplex detection of KRAS mutations in formalin-fixed, paraffin- embedded colorectal cancer samples. Biotechniques 2015;58:205–6.Yang W., Shelton D.N., Berman J.R. et al. Droplet digital™ PCR: multiplex detection of KRAS mutations in formalin-fixed, paraffin- embedded colorectal cancer samples. Biotechniques 2015;58:205–6.3. Huang Q., Liu Z., Liao Y. et al. Multiplex fluorescence melting curve analysis for mutation detection with dual-labeled, selfquenched probes. PLoS One 2011;6(4):e19206.Huang Q., Liu Z., Liao Y. et al. Multiplex fluorescence melting curve analysis for mutation detection with dual-labeled, selfquenched probes. PLoS One 2011;6(4):e19206.4. Botezatu I.V., Nechaeva I.O., Stroganova A.M. et al. Optimization of melting analysis with TaqMan probes for detection of KRAS, NRAS and BRAF mutations. Anal Biochem 2015;491: 75–83.Botezatu I.V., Nechaeva I.O., Stroganova A.M. et al. Optimization of melting analysis with TaqMan probes for detection of KRAS, NRAS and BRAF mutations. Anal Biochem 2015;491: 75–83.5. Botezatu I.V., Nechaeva I.O., Stroganova A.M. et al. Asymmetric real-time PCR and multiplex melting curve analysis with TaqMan probes for detecting PIK3CA mutations. Data Brief 2015;5: 913–7.Botezatu I.V., Nechaeva I.O., Stroganova A.M. et al. Asymmetric real-time PCR and multiplex melting curve analysis with TaqMan probes for detecting PIK3CA mutations. Data Brief 2015;5: 913–7.6. Botezatu I.V., Panchuk I.O, Stroganova A.M. et al. TaqMan probes as blocking agents for enriched PCR amplification and DNA melting analysis of mutant genes. Biotechniques 2017;62(2):62–8.Botezatu I.V., Panchuk I.O, Stroganova A.M. et al. TaqMan probes as blocking agents for enriched PCR amplification and DNA melting analysis of mutant genes. Biotechniques 2017;62(2):62–8.7. Schutz E., von Ahsen N. Spreadsheet software for thermodynamic melting point prediction of oligonucleotide hybridization with and without mismatches. Biotechniques 1999;27(6):1218–22.Schutz E., von Ahsen N. Spreadsheet software for thermodynamic melting point prediction of oligonucleotide hybridization with and without mismatches. Biotechniques 1999;27(6):1218–22.8. Orita M., Iwahana H., Kanazawa H. et al. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as singlestrand conformation polymorphisms. Proc Natl Acad Sci U S A 1989;86(8):2766–70.Orita M., Iwahana H., Kanazawa H. et al. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as singlestrand conformation polymorphisms. Proc Natl Acad Sci U S A 1989;86(8):2766–70.9. Yap E.P., McGee J.O. Nonisotopic discontinuous phase single strand conformation polymorphism (DP-SSCP): genetic profiling of D-loop of human mitochondrial (mt) DNA. Nucleic Acids Res 1993;21:4155.Yap E.P., McGee J.O. Nonisotopic discontinuous phase single strand conformation polymorphism (DP-SSCP): genetic profiling of D-loop of human mitochondrial (mt) DNA. Nucleic Acids Res 1993;21:4155.10. Guthrie P.A., Gaunt T.R., Abdollahi M.R. et al. Amplification ratio control system for copy number variation genotyping. Nucleic Acids Res 2011;39(8):e54.Guthrie P.A., Gaunt T.R., Abdollahi M.R. et al. Amplification ratio control system for copy number variation genotyping. Nucleic Acids Res 2011;39(8):e54.