СЕЛЕКТИВНОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ KRAS-СИГНАЛЬНОГО КАСКАДА ПРИ КОМБИНИРОВАННОМ ВОЗДЕЙСТВИИ НИЗКИХ ДОЗ РАПАМИЦИНА И ПАКЛИТАКСЕЛА IN VIVO

Введение. Применение соединений, потенциально способных блокировать функционирование сигнального каскада онкогена KRAS, является одним из перспективных направлений современной онкофармакологии.

Цель исследования – изучить эффекты комбинированного действия рапамицина (RAP) и паклитаксела (РАС) на трансгенной линии зебрафиш (Danio rerio), характеризующейся постоянной экспрессией в клетках эпидермиса онкогена KRASV12, конъюгированного c зеленым флуоресцентным белком (green fluorescent protein, GFP). Эта линия имеет измененный фенотип, обусловленный гиперплазией кератиноцитов и флуоресценцией в них GFP-репортера.

Материалы и методы. Эмбрионы рыб в возрасте 6 ч помещали в среду с добавлением 0,1 % раствора диметилсульфоксида (контроль) и различных доз исследуемых препаратов или их комбинаций. Время инкубации составило 72 ч, после чего проводили количественную оценку интенсивности флуоресценции GFP-репортера в клетках эпидермиса с помощью компьютерной морфометрии.

Результаты. При воздействии RAP выраженность фенотипических изменений уменьшалась вплоть до полной нормализации фенотипа в дозе 50–400 нмоль. РАС в дозе 50–250 нмоль не оказывал токсического влияния на развитие эмбрионов, однако дозозависимо повышал уровень флуоресценции репортера, что свидетельствует об усилении экспрессии онкогена KRAS. Воздействие низких доз RAP (10–25 нмоль), а также PAC (10 нмоль) по отдельности не оказывало статистически значимого влияния на выраженность трансформированного фенотипа. В то же время использование различных комбинаций низких доз этих препаратов (RAP в дозе 10–25 нмоль в сочетании с PAC в дозе 10–50 нмоль) существенно снижало регистрируемый уровень флуоресценции, полностью нормализуя фенотип трансгенных рыб.

Заключение. Выявлено взаимное потенцирующее действие низких доз RAP и PAC, приводящее к избирательному ингибированию сигнального каскада онкогена KRAS, что свидетельствует о перспективности дальнейших исследований комбинации этих препаратов для таргетной терапии опухолей.

1. Bos J. L. Ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Res 1989;49(17):4682–9. PMID: 2547513.

2. Easton J. B., Houghton P. J. mTOR and cancer therapy. Oncogene 2006;25(48): 6436–46. DOI: 10.1038/sj.onc.1209886. PMID: 17041628.

3. Conciatori F., Ciuffreda L., Bazzichetto C. et al. mTOR cross-talk in cancer and potential for combination therapy. Cancers (Basel) 2018;10(1):E23. DOI: 10.3390/cancers10010023. PMID: 29351204.

4. Blagosklonny M. V. Rapalogs in cancer prevention: anti-aging or anticancer? Cancer Biol Ther 2012;13(14):1349–54. DOI: 10.4161/cbt.22859. PMID: 23151465.

5. Mondesire W. H., Jian W., Zhang H. et al. Targeting mammalian target of rapamycin synergistically enhances chemotherapyinduced cytotoxicity in breast cancer cells. Clin Cancer Res 2004;10(20):7031–42. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-04-0361. PMID: 15501983.

6. Shafer A., Zhou C., Gehrig P. A. et al. Rapamycin potentiates the effects of paclitaxel in endometrial cancer cells through inhibition of cell proliferation and induction of apoptosis. Int J Cancer 2010;126(5):1144–54. DOI: 10.1002/ijc.24837. PMID: 19688827.

7. Okano J., Rustgi A. K. Paclitaxel induces prolonged activation of the Ras/MEK/ERK pathway independently of activating the programmed cell death machinery. J Biol Chem 2001;276(22):19555–64. DOI: 10.1074/jbc.M011164200. PMID: 11278851.

8. Mabuchi S., Ohmichi M., Kimura A. et al. Inhibition of phosphorylation of BAD and Raf-1 by Akt sensitizes human ovarian cancer cells to paclitaxel. J Biol Chem 2002;277(36):33490–500. DOI: 10.1074/jbc.M204042200. PMID: 12087097.

9. Amatruda J. F., Patton E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol 2008;271:1–34. DOI: 10.1016/S1937-6448(08)01201-X. PMID: 19081540.

10. Gong Z., Ju B., Wang X. et al. Green fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin 8. Dev Dyn 2002;223(2):204–15. DOI: 10.1002/dvdy.10051. PMID: 11836785.

11. Liu S., Leach S. D. Zebrafish models for cancer. Annu Rev Pathol 2011;6:71–93. DOI: 10.1146/annurev-pathol-011110- 130330. PMID: 21261518.

12. Astone M., Dankert E. N., Alam S. K., Hoeppner L. H. Fishing for cures: the alLURE of using zebrafish to develop precision oncology therapies. NPJ precision oncology 2017;1:39. DOI: 10.1038/s41698-017-0043-9. PMID: 29376139.

13. Mizgireuv I. V., Revskoy S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res 2006;66(6):3120–5. DOI: 10.1158/0008–5472.CAN-05-3800. PMID: 16540662.

14. Mizgirev I. V., Revskoy S. A new zebrafish model for experimental leukemia therapy. Cancer Biol Ther 2010;9(11):895–902. PMID: 20339318.

15. Kuscu C. Effect of rapamycin on early development of Zebrafish (Danio rerio). A thesis submitted to the Department of Molecular Biology and Genetics of Bilkent University, 2004. 77 p.

16. Nguyen A. T., Emelyanov A., Koh C. H. et al. An inducible KRASV12 transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Dis Model Mech 2012;5(1):63–72. DOI: 10.1242/dmm.008367. PMID: 21903676.

17. Fernandez Del Ama L., Jones M., Walker P. et al. Reprofiling using a zebrafish melanoma model reveals drugs cooperating with targeted therapeutics. Oncotarget 2016;7(26):40348–61. DOI: 10.18632/oncotarget.9613. PMID: 27248171.

18. Lisse T. S., Middleton L. J., Pellegrini A. D. et al. Paclitaxel-induced epithelial damage and ectopic MMP-13 expression promotes neurotoxicity in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA 2016;113(15):E2189–98. DOI: 10.1073/pnas.1525096113. PMID: 27035978.

19. Wang H., Li D., Li X. et al. Mammalian target of rapamycin inhibitor RAD001 sensitizes endometrial cancer cells to paclitaxel-induced apoptosis via the induction of autophagy. Oncol Lett 2016;12(6):5029–35. DOI: 10.3892/ol.2016.5338. PMID: 28105210.

20. Zou H., Li L., Garcia Carcedo I. et al. Synergistic inhibition of colon cancer cell growth with nanoemulsion-loaded paclitaxel and PI3K/mTOR dual inhibitor BEZ235 through apoptosis. Int J Nanomedicine 2016;11:1947–58. DOI: 10.2147/IJN.S100744. PMID: 27226714.

21. Campone M., Levy V., Bourbouloux E. et al. Safety and pharmacokinetics of paclitaxel and the oral mTOR inhibitor everolimus in advanced solid tumours. Br J Cancer 2009;100(2):315–21. DOI: 10.1038/sj.bjc.6604851. PMID: 19127256.

22. Hurvitz S. A., Dalenc F., Campone M. et al. A Phase 2 study of everolimus combined with trastuzumab and paclitaxel in patients with HER2-overex-pressing advanced breast cancer that progressed during prior trastuzumab and taxane therapy. Breast Cancer Res Treat 2013;141:437–46. DOI: 10.1007/s10549-013-2689-5. PMID: 24101324.