Валидация тест-системы на основе высокопроизводительного секвенирования для детектирования микросателлитной нестабильности в образцах колоректального рака

Введение. На сегодняшний день в рутинной клинической практике для определения микросателлитной нестабильности (MSI) и дефицита репарации ошибочно спаренных оснований (dMMR) используют стандартные методы на основе полимеразной цепной реакции (пЦР) или иммуногистохимического исследования. Выявление MSI с помощью метода высокопроизводительного секвенирования (секвенирования нового поколения – next generation sequencing, NGS) представляет особый интерес в связи с возможностью анализа большого количества микросателлитов, а также одновременного исследования альтераций в терапевтически значимых генах.
Цель исследования – валидация ампликонной NGS-панели для анализа MSI и альтераций в генах, клинически значимых при колоректальном раке.
Материалы и методы. Высокопроизводительное секвенирование для анализа MSI проводилось на фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE) образцах пациентов с колоректальным раком всех стадий с использованием ампликонной панели «Соло-тест Драйвер» (Россия), охватывающей 38 генов и 39 коротких тандемных повторов (мононуклеотидов). В качестве референсного метода применяли пЦР по 5 локусам (BAT25, BAT26, NR21, NR24 и NR27). В ходе NGS MSI оценивали на основе распределения κ-меров. Статистический анализ проводили с использованием коэффициента каппа коэна (κ), u-критерия Манна–Уитни и точного теста Фишера.
Результаты. Разработана ампликонная NGS-панель для анализа MSI в 39 локусах, а также альтераций в 39 генах, которая провалидирована на 160 архивных FFPE-образцах колоректального рака. по результатам ПЦР 42 (26,25 %) образца оказались MSI-положительными, 118 (73,75 %) – MSI-отрицательными. Результаты ПЦР и NGS были конкордантными в 98,75 % (158/160) случаев.
Заключение. коэффициент κ составил 0,97, что свидетельствует о высокой конкордантности анализа MSI с помощью ПЦР и разработанной тест-системы на основе NGS.

1. Baretti M., Le D.T. DNA mismatch repair in cancer. Pharmacol Ther 2018;189:45–62. DOI: 10.1016/j.pharmthera.2018.04.004 2. Ma J., Setton J., Lee N.Y. et al. The therapeutic significance of mutational signatures from DNA repair deficiency in cancer. Nat Commun 2018;9(1):3292. DOI: 10.1038/s41467-018-05228-y

2. Lepore Signorile M., Disciglio V., Di Carlo G. et al. From genetics to histomolecular characterization: an insight into colorectal carcinogenesis in Lynch syndrome. Int J Mol Sci 2021;22(13):6767. DOI: 10.3390/ijms22136767

3. Lower S.S., McGurk M.P., Clark A.G. et al. Satellite DNA evolution: old ideas, new approaches. Curr Opin Genet Dev 2018;49:70–8. DOI: 10.1016/j.gde.2018.03.003

4. Kavun A., Veselovsky E., Lebedeva A. et al. Microsatellite instability: a review of molecular epidemiology and implications for immune checkpoint inhibitor therapy. Cancers 2023;15(8):2288. DOI: 10.3390/cancers15082288

5. Luchini C., Bibeau F., Ligtenberg M.J.L. et al. ESMO recommendations on microsatellite instability testing for immunotherapy in cancer, and its relationship with PD-1/PD-L1 expression and tumour mutational burden: a systematic reviewbased approach. Ann Oncol 2019;30(8):1232–43. DOI: 10.1093/annonc/mdz116

6. Yakushina V., Kavun A., Veselovsky E. et al. Microsatellite Instability detection: the current standards, limitations, and misinterpretations. JCO Precis Oncol 2023;7:e2300010. DOI: 10.1200/po.23.00010

7. Amato M., Franco R., Facchini G. et al. Microsatellite instability: from the implementation of the detection to a prognostic and predictive role in cancers. Int J Mol Sci 2022;23(15):8726. DOI: 10.3390/ijms23158726

8. Umar A., Boland C.R., Terdiman J.P. et al. Revised Bethesda guidelines for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome) and microsatellite instability. J Natl Cancer Inst 2004;96(4):261–8. DOI: 10.1093/jnci/djh034

9. Goel A., Nagasaka T., Hamelin R. et al. An optimized pentaplex PCR for detecting DNA mismatch repair-deficient colorectal cancers. PLoS One 2010;5(2):e9393. DOI: 10.1371/journal.pone.0009393

10. Coelho H., Jones-Hughes T., Snowsill T. et al. A systematic review of test accuracy studies evaluating molecular micro-satellite instability testing for the detection of individuals with Lynch syndrome. BMC Cancer 2017;17(1):836. DOI: 10.1186/s12885-017-3820-5

11. Parente P., Grillo F., Vanoli A. et al. The day-to-day practice of MMR and MSI assessment in colorectal adenocarcinoma: what we know and what we still need to explore. Dig Dis 2023;41(5):746–56. DOI: 10.1159/000531003

12. Ukkola I., Nummela P., Kero M., Ristimäki A. Diagnostic performance of Idylla MSI test in colorectal cancer biopsies. Diagn Pathol 2023;18(1):39. DOI: 10.1186/s13000-023-01328-6

13. Cohen R., Hain E., Buhard O. et al. Association of primary resistance to immune checkpoint inhibitors in metastatic colorectal cancer with misdiagnosis of microsatellite instability or mismatch repair deficiency status. JAMA Oncol 2019;5(4):551–5. DOI: 10.1001/jamaoncol.2018.4942

14. Shia J. The diversity of tumours with microsatellite instability: molecular mechanisms and impact upon microsatellite instability testing and mismatch repair protein immunohistochemistry. Histopathology 2020;78(4):485–97. DOI: 10.1111/his.14271

15. Cortes-Ciriano I., Lee S., Park W.Y. et al. A molecular portrait of microsatellite instability across multiple cancers. Nat Commun 2017;8(1):15180. DOI: 10.1038/ncomms15180

16. Yang R.K., Chen H., Roy-Chowdhuri S. et al. Clinical testing for mismatch repair in neoplasms using multiple laboratory methods. Cancers 2022;14(19):4550. DOI: 10.3390/cancers14194550

17. Kim T.M., Laird P.W., Park P.J. The landscape of microsatellite instability in colorectal and endometrial cancer genomes. Cell 2013;155(4):858–68. DOI: 10.1016/j.cell.2013.10.015

18. Kuismanen S.A., Moisio A.L., Schweizer P. et al. Endometrial and colorectal tumors from patients with hereditary nonpolyposis colon cancer display different patterns of microsatellite instability. Am J Pathol 2002;160(6):1953–8. DOI: 10.1016/s0002-9440(10)61144-3

19. Gilson P., Merlin J.L., Harlé A. Detection of microsatellite instability: state of the art and future applications in circulating tumour DNA (ctDNA). Cancers 2021;13(7):1491. DOI: 10.3390/cancers13071491

20. Ratovomanana T., Cohen R., Svrcek M. et al. Performance of next-generation sequencing for the detection of microsatellite instability in colorectal cancer with deficient DNA mismatch repair. Gastroenterology 2021;161(3):814–26.e7. DOI: 10.1053/j.gastro.2021.05.007

21. Lebedeva A., Belova E., Grigoreva T. et al. MSI detection by NGS using tumor samples and liquid biopsy for patients with solid tumors: a single institution experience. Ann Oncol 2023;8(1):1–55. DOI: 10.1016/esmoop/esmoop101646

22. Cisneros-Villanueva M., Hidalgo-Pérez L., Rios-Romero M. et al. Cell-free DNA analysis in current cancer clinical trials: a review. Br J Cancer 2022;126(3):391–400. DOI: 10.1038/s41416-021-01696-0

23. Yu F., Makrigiorgos A., Leong K.W. et al. Sensitive detection of microsatellite instability in tissues and liquid biopsies: recent developments and updates. Comput Struct Biotechnol J 2021;19:4931–40. DOI: 10.1016/j.csbj.2021.08.037

24. Jia P., Yang X., Guo L. et al. MSIsensor-pro: fast, accurate, and matched-normal-sample-free detection of microsatellite instability. Genomics Proteomics Bioinformatics 2020;18(1):65–71. DOI: 10.1016/j.gpb.2020.02.001

25. Trabucco S.E., Gowen K., Maund S.L. et al. A novel nextgeneration sequencing approach to detecting microsatellite instability and pan-tumor characterization of 1000 microsatellite instability-high cases in 67,000 patient samples. J Mol Diagn 2019;21(6):1053–66. DOI: 10.1016/j.jmoldx.2019.06.011

26. Zhao L., Shan G., Li L. et al. A robust method for the rapid detection of microsatellite instability in colorectal cancer. Oncol Letters 2020;20(2):1982–8. DOI: 10.3892/ol.2020.11702

27. Froyen G., Geerdens E., Berden S. et al. Diagnostic validation of a comprehensive targeted panel for broad mutational and biomarker analysis in solid tumors. Cancers 2022;14(10):2457. DOI: 10.3390/cancers14102457

28. Zheng K., Wan H., Zhang J. et al. A novel NGS-based microsatellite instability (MSI) status classifier with 9 loci for colorectal cancer patients. J Transl Med 2020;18(1):215. DOI: 10.1186/s12967-020-02373-1

29. Gan C., Love C., Beshay V. et al. Applicability of next generation sequencing technology in microsatellite instability testing. Genes 2015;6(1):46–59. DOI: 10.3390/genes6010046

30. Hirotsu Y., Nagakubo Y., Amemiya K. et al. Microsatellite instability status is determined by targeted sequencing with MSIcall in 25 cancer types. Clinica Chimica Acta 2020;502:207–13. DOI: 10.1016/j.cca.2019.11.002

31. Yuza K., Nagahashi M., Watanabe S. et al. Hypermutation and microsatellite instability in gastrointestinal cancers. Oncotarget 2017;8(67):112103–15. DOI: 10.18632/oncotarget.22783

32. Goodman A.M., Sokol E.S., Frampton G.M. et al. Microsatellitestable tumors with high mutational burden benefit from immunotherapy. Cancer Immunol Res 2019;7(10):1570–3. DOI: 10.1158/2326-6066.cir-19-0149

33. McGivern A., Wynter C.V.A., Whitehall V.L.J. et al. Promoter hypermethylation frequency and BRAF mutations distinguish hereditary non-polyposis colon cancer from sporadic MSI-H colon cancer. Familial Cancer 2002;3(2):101–7. DOI: 10.1023/b:fame.0000039861.30651.c8

34. Bond C.E., Liu C., Kawamata F. et al. Oncogenic BRAF mutation induces DNA methylation changes in a murine model for human serrated colorectal neoplasia. Epigenetics 2018;13(1):40–8. DOI: 10.1080/15592294.2017.1411446