Жидкостная биопсия колоректального рака: новый подход к оценке аберрантного метилирования гена SEPT9

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Гиперметилированные CpG-островки в промоторах генов-супрессоров (в частности, SEPT9) – клинически значимые опухолевые маркеры, широко используемые в жидкостной биопсии. Для количественной оценки гиперметилированных ДНК обычно используют полимеразную цепную реакцию в реальном времени с метилспецифическими праймерами. Этот метод требует нормализации данных, зависит от степени вариабельности числа копий генов-калибраторов и весьма трудоемок.

Цель исследования – разработка альтернативного метода оценки аберрантного метилирования посредством количественного анализа плавления ДНК (qDMA, quantitative DNA melting analysis).

Материалы и методы. Образцы ДНК, выделенные из плазмы крови здоровых доноров и больных колоректальным раком, анализировали методом qDMA, включающим: 1) асимметричную полимеразную цепную реакцию с метилнезависимыми индивидуально подобранными праймерами к гену SEPT9; 2) использование зонда TaqMan, гибридизующегося с 2 CpG-динуклеотидами ампликона; 3) постамплификационное плавление гибридов зонд/ампликон; 4) количественный анализ плавления ДНК.

Результаты. Метод испытан на гене SEPT9 (применялся в жидкостной биопсии колоректального рака). Различия в степени метилирования SEPT9 между группами здоровых (n = 41) и больных (n = 39) людей статистически значимы (p <0,0001). Определена диагностическая эффективность qDMA: AUC ROC (area under curve – площадь под ROC-кривой) – 0,812 (после перекрестной валидизации – 0,801), чувствительность – 90 %, специфичность – 66 %.

Заключение. Предлагаемый метод количественной оценки аберрантно метилированных ДНК прост, реализуется в закрытом формате, не требует нормализации и построения стандартных кривых. Предполагается возможность его оптимизации посредством применения мультиплексного варианта с одновременным анализом нескольких маркеров.

Об авторах

И. В. Ботезату

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-0297-4963

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

Россия

В. Н. Кондратова

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-0614-8789

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

Россия

А. М. Строганова

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7297-5240

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

Россия

С. Л. Дранко

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-3315-0817

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

Россия

А. В. Лихтенштейн

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: alicht@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0190-5069

Анатолий Владимирович Лихтенштейн

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

Россия

Список литературы

  1. Serrano M.J., Garrido-Navas M.C., Diaz Mochon J.J. et al. Precision prevention and cancer interception: the new challenges of liquid biopsy. Cancer Discovery 2020;10(11):1635–44. doi: 10.1158/2159-8290.CD-20-0466.
  2. Cescon D.W., Bratman S.V., Chan S.M. et al. Circulating tumor DNA and liquid biopsy in oncology. Nature Cancer 2020;1:276–90. doi: 10.1038/s43018-020-0043-5.
  3. Xiong Z., Laird P.W. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res 1997;25(12):2532–4. doi: 10.1093/nar/25.12.2532.
  4. Worm J., Aggerholm A., Guldberg P. In-tube DNA methylation profiling by fluorescence melting curve analysis. Clinical Chemistry 2001;47(7):1183–9.
  5. Tse M.Y., Ashbury J.E., Zwingerman N. et al. A refined, rapid and reproducible high resolution melt (HRM)-based method suitable for quantification of global LINE-1 repetitive element methylation. BMC Research Notes 2011;4:565. doi: 10.1186/1756-0500-4-565.
  6. Quillien V., Lavenu A., Karayan-Tapon L. et al. Comparative assessment of 5 methods (methylation-specific polymerase chain reaction, MethyLight, pyrosequencing, methylation-sensitive high-resolution melting, and immunohistochemistry) to analyze O6-methylguanine-DNA-methyltranferase in a series of 100 glioblastoma patients. Cancer 2012;118(17):4201–11. doi: 10.1002/cncr.27392.
  7. Korshunova Y., Maloney R.K., Lakey N. et al. Massively parallel bisulphite pyrosequencing reveals the molecular complexity of breast cancer-associated cytosine-methylation patterns obtained from tissue and serum DNA. Genome Res 2008;18(1):19–29. doi: 10.1101/gr.6883307.
  8. Sepulveda A.R., Jones D., Ogino S. et al. CpG methylation analysis-current status of clinical assays and potential applications in molecular diagnostics: a report of the Association for Molecular Pathology. J Mol Diagn 2009;11(4):266–78. doi: 10.2353/jmoldx.2009.080125.
  9. Egger G., Wielscher M., Pulverer W. et al. DNA methylation testing and marker validation using PCR: diagnostic applications. Expert Rev Mol Diagn 2012;12(1):75–92. doi: 10.1586/erm.11.90.
  10. Dietrich D., Jung M., Puetzer S. et al. Diagnostic and prognostic value of SHOX2 and SEPT9 DNA methylation and cytology in benign, paramalignant and malignant pleural effusions. PLoS ONE 2013;8(12):e84225. doi: 10.1371/journal.pone.0084225.
  11. De Vos L., Gevensleben H., Schrock A. et al. Comparison of quantification algorithms for circulating cell-free DNA methylation biomarkers in blood plasma from cancer patients. Clin Epigenetics 2017;9(1):125. doi: 10.1186/s13148-017-0425-4.
  12. Pharo H.D., Honne H., Vedeld H.M. et al. Experimental factors affecting the robustness of DNA methylation analysis. Sci Rep 2016;6:33936. doi: 10.1038/srep33936.
  13. Pharo H.D., Andresen K., Berg K.C.G. et al. A robust internal control for high-precision DNA methylation analyses by droplet digital PCR. Clin Epigenetics 2018;10:24. doi: 10.1186/s13148-018-0456-5.
  14. Warnecke P.M., Stirzaker C., Melki J.R. et al. Detection and measurement of PCR bias in quantitative methylation analysis of bisulphite-treated DNA. Nucleic Acids Res 1997;25(21):4422–6. doi: 10.1093/nar/25.21.4422.
  15. Wojdacz T.K., Hansen L.L., Dobrovic A. A new approach to primer design for the control of PCR bias in methylation studies. BMC Res Notes 2008;1:54. doi: 10.1186/1756-0500-1-54.
  16. Wojdacz T.K., Borgbo T., Hansen L.L. Primer design versus PCR bias in methylation independent PCR amplifications. Epigenetics 2009;4(4):231–4. doi: 10.4161/epi.9020.
  17. Botezatu I.V., Kondratova V.N., Shelepov V.P. et al. Asymmetric mutantenriched polymerase chain reaction and quantitative DNA melting analysis of KRAS mutation in colorectal cancer. Anal Biochem 2020;590:1–9. doi: 10.1016/j.ab.2019.113517.
  18. Kondratova V.N., Botezatu I.V., Shelepov V.P. et al. SLAM-MS: mutation scanning of stem-loop amplicons with TaqMan probes by quantitative DNA melting analysis. Sci Rep 2020;10:5476. doi: 10.1038/s41598-020-62173-x.
  19. Лазаревич Н.Л., Абрамов П.М., Федорова М.Д. и др. Идентификация нового сайта метилирования в промоторном районе гена Sept9 для диагностики гепатоцеллюлярной карциномы. Успехи молекулярной онкологии 2019;6(4):26–37. doi: 10.17650/2313-805X-2019-6-4-26-37.
  20. Sui J., Wu X., Wang C. et al. Discovery and validation of methylation signatures in blood-based circulating tumor cell-free DNA in early detection of colorectal carcinoma: a case-control study. Clin Epigenetics 2021;13:26. doi: 10.1186/s13148-020-00985-4.
  21. Wasserkort R., Kalmar A., Valcz G. et al. Aberrant septin 9 DNA methylation in colorectal cancer is restricted to a single CpG island. BMC Cancer 2013;13:398. doi: 10.1186/1471-2407-13-398.
  22. Schutz E., von Ahsen N. Spreadsheet software for thermodynamic melting point prediction of oligonucleotide hybridization with and without mismatches. Biotechniques 1999;27(6):1218–22, 1224. doi: 10.2144/99276bc04.
  23. Mazzara S., Rossi R.L., Grifantini R. et al. CombiROC: an interactive web tool for selecting accurate marker combinations of omics data. Sci Rep 2017;7:45477. doi: 10.1038/srep45477.
  24. Botezatu I.V., Panchuk I.O., Stroganova A.M. et al. TaqMan probes as blocking agents for enriched PCR amplification and DNA melting analysis of mutant genes. Biotechniques 2017;62(2):62–8. doi: 10.2144/000114515.
  25. Montgomery J.L., Rejali N., Wittwer C.T. The influence of nucleotide sequence and temperature on the activity of thermostable DNA polymerases. J MolDiagn 2014;16(3):305–13. doi: 10.1016/j.jmoldx.2014.01.006.
  26. Livak K.J., Flood S.J., Marmaro J. et al. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl 1995;4(6):357–62. doi: 10.1101/gr.4.6.357.
  27. Huang Q., Liu Z., Liao Y. et al. Multiplex fluorescence melting curve analysis for mutation detection with dual-labeled, self-quenched probes. PLoS ONE 2011;6(4):e19206. doi: 10.1371/journal.pone.0019206.
  28. Botezatu I.V., Nechaeva I.O., Stroganova C.A. et al. Optimization of melting analysis with Taqman probes for detection of KRAS, NRAS and BRAF mutations. Anal Biochem 2015;491:75–83. doi: 10.1016/j.ab.2015.09.005.
  29. Armbruster D.A., Pry T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin Biochem Rev 2008;29(Suppl 1):S49–52.
  30. Wojdacz T.K., Dobrovic A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS- HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res 2007;35(6):e41. doi: 10.1093/nar/gkm013.
  31. Malentacchi F., Forni G., Vinci S. et al. Quantitative evaluation of DNA methylation by optimization of a differential-high resolution melt analysis protocol. Nucleic Acids Res 2009;37(12):e86. doi: 10.1093/nar/gkp383.
  32. Spitzwieser M., Entfellner E., Werner B. et al. Hypermethylation of CDKN2A exon 2 in tumor, tumor-adjacent and tumor-distant tissues from breast cancer patients. BMC Cancer 2017;17:260. doi: 10.1186/s12885-017-3244-2.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© ,


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 57560 от  08.04.2014.