Отправить статью по E-mail Выявление мутаций в «горячих» участках генома: ампликоны-«шпильки» в методе плавления ДНК
- Авторы: Кондратова В.Н.1, Ботезату И.В.1, Шелепов В.П.1, Лихтенштейн А.В.1
-
Учреждения:
- НИИ канцерогенеза ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
- Выпуск: Том 4, № 1 (2017)
- Страницы: 46-52
- Раздел: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
- Статья опубликована: 18.04.2017
- URL: https://umo.abvpress.ru/jour/article/view/88
- DOI: https://doi.org/10.17650/2313-805X-2017-4-1-46-52
- ID: 88
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Амплификация с последующим плавлением ДНК с зондами TaqMan эффективно выявляет мутации в «горячих» участках генома. Однако необходимость проводить полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в асимметричном варианте обусловливает ряд ограничений этого метода: 1) невозможность количественного анализа из‑за снижения эффективности амплификации; 2) необходимость выполнения 2 независимых ПЦР для выявления мутаций в комплементарных нитях ампликона; 3) усложнение дизайна ПЦР. Преодоление этих ограничений оказалось возможным при использовании в симметричной ПЦР комбинированных праймеров, состоящих из универсальной и специфической последовательностей: образующиеся в результате однонитевые «шпилечные» (hairpin) ампликоны (sense и antisense) не способны ренатурировать друг с другом, но независимо гибридизуются с присутствующими в среде зондами TaqMan (antisense и sense соответственно). Разработанный способ позволяет в одном тесте получить количественные (число копий) и качественные (наличие мутаций в обеих нитях ампликона) характеристики исследуемого участка ДНК.
Ключевые слова
Об авторах
В. Н. Кондратова
НИИ канцерогенеза ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Email: fake@neicon.ru
Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24 Россия
И. В. Ботезату
НИИ канцерогенеза ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Email: fake@neicon.ru
Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24 Россия
В. П. Шелепов
НИИ канцерогенеза ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Email: fake@neicon.ru
Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24 Россия
А. В. Лихтенштейн
НИИ канцерогенеза ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Автор, ответственный за переписку.
Email: alicht@mail.ru
Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24 Россия
Список литературы
- Prior I.A., Lewis P.D., Mattos C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Cancer Res 2012;72(10): 2457–67.
- Yang W., Shelton D.N., Berman J.R. et al. Droplet digital™ PCR: multiplex detection of KRAS mutations in formalin-fixed, paraffin- embedded colorectal cancer samples. Biotechniques 2015;58:205–6.
- Huang Q., Liu Z., Liao Y. et al. Multiplex fluorescence melting curve analysis for mutation detection with dual-labeled, selfquenched probes. PLoS One 2011;6(4):e19206.
- Botezatu I.V., Nechaeva I.O., Stroganova A.M. et al. Optimization of melting analysis with TaqMan probes for detection of KRAS, NRAS and BRAF mutations. Anal Biochem 2015;491: 75–83.
- Botezatu I.V., Nechaeva I.O., Stroganova A.M. et al. Asymmetric real-time PCR and multiplex melting curve analysis with TaqMan probes for detecting PIK3CA mutations. Data Brief 2015;5: 913–7.
- Botezatu I.V., Panchuk I.O, Stroganova A.M. et al. TaqMan probes as blocking agents for enriched PCR amplification and DNA melting analysis of mutant genes. Biotechniques 2017;62(2):62–8.
- Schutz E., von Ahsen N. Spreadsheet software for thermodynamic melting point prediction of oligonucleotide hybridization with and without mismatches. Biotechniques 1999;27(6):1218–22.
- Orita M., Iwahana H., Kanazawa H. et al. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as singlestrand conformation polymorphisms. Proc Natl Acad Sci U S A 1989;86(8):2766–70.
- Yap E.P., McGee J.O. Nonisotopic discontinuous phase single strand conformation polymorphism (DP-SSCP): genetic profiling of D-loop of human mitochondrial (mt) DNA. Nucleic Acids Res 1993;21:4155.
- Guthrie P.A., Gaunt T.R., Abdollahi M.R. et al. Amplification ratio control system for copy number variation genotyping. Nucleic Acids Res 2011;39(8):e54.
Дополнительные файлы
